單細胞轉錄組測序產生的數據是成百上千個基因在上萬個細胞中的表達情況，屬于高維數據，我們需要對數據進行嚴格的質控與過濾，將合格的數據降維到低維子空間，使數據可視化。

上一期已經帶大家了解了scRNA-Seq數據的預處理，那么本期，小編就來介紹一下數據分析的標準化與聚類分析。

一、上海烈冰科技數據分析流程介紹

二、工具介紹

Seurat_Normalized（標準化）——采用Seurat package對數據進行過濾并校正批次效應（Batch Effect），采用PCA算法及tSNE算法對基因表達矩陣進行降維處理和信息可視化展示。

Seurat_Cluster（聚類分析）——根據基因表達的情況，通過無監督聚類算法（Graph-based clustering或k-means clustering) 將降維后的細胞聚類分群。再通過Wilcoxon秩和檢驗分析計算出不同細胞類群的標識基因（Marker Gene），并對所屬細胞類群進行推測和鑒定。

三、結果展示

（一） 數據標準化

1.線粒體RNA占比：

由于Dead Cell胞內RNA會流出，線粒體RNA占比會隨之增高，因此我們一般通過設定線粒體RNA占比閾值來過濾Dead Cell。

左圖描述了每個細胞線粒體RNA占比—UMI數量相關性，紅色和黑色圓點代表兩個樣本的細胞。X軸代表每個細胞對應的UMI數量，Y軸代表每個細胞線粒體RNA占比；右圖為細胞線粒體RNA占比分布的Violin圖。

圖中線粒體RNA占比閾值建議設為0.2，線粒體RNA占比超過0.2的細胞認為是Dead Cell，可將其過濾掉。當然，不同類型的細胞線粒體RNA占比也不同，例如心肌細胞、肝細胞等高代謝、凋亡類細胞，其線粒體RNA占比相對較高。因此，需要結合具體的細胞類型來最終決定線粒體RNA占比的閾值。

2.細胞的基因數量：

我們一般通過設定細胞的最小基因數量去除假細胞和低質量細胞（Low Quality Cell）；通過設定細胞的最大基因數量可以一定程度上去除雙細胞（Doublet Cell）。

左圖為每個細胞的基因—UMI數量相關性分析圖，右圖為每個細胞基因數量分布的Violin圖。圖中基因數量閾值建議設定為200-6000，可有效去除假細胞、低質量細胞和雙細胞。

3.PCA分析：

該圖主要描述了不同樣本中所有細胞在PC1和PC2（即主成分分析中影響最大的兩個主成分）所組成的面中的定位情況。

4.t-SNE圖：

主要展示了每個樣本中所有細胞的tSNE定位情況、樣本融合情況，以及通過基因數量、UMI數量、線粒體RNA占比進行染色的情況，如下所示：

（二）聚類分析

1.細胞分群的t-SNE圖：

該圖代表t-SNE定位并基于Graphcluster或者KMean算法無監督聚類后的分群情況。

左圖中cluster8被其他群分割成兩部分，這樣的t-SNE分群結果并不是特別理想。建議調整分析時的resolution參數，將其調大，使分群更加細致。將resolution參數由0.8調至1.0，得到右圖較好的t-SNE分群結果。

2. Top20 Marker基因的Heatmap：

可觀察特定marker基因在不同cluster的表達差異，以此初步判斷細胞類型及類群合并。采用細線區分不同的Cluster，顏色深淺代表基因表達高低，其中黃色為高表達，暗紅色為低表達。根據各cluster的基因表達的整體類似度，下圖可以初步判斷將cluster0、3合為一群，cluster6、7合為一群，cluster5、8、12合為一群。

3.Feature plot：

該圖主要描繪了選定Cluster中 Marker 基因在所有單細胞中的分布情況，更加直觀的了解marker基因的整體表達情況，用于判定cluster所屬的細胞類型。根據經典特異性marker基因的Feature plot，可以初步判斷出T細胞（CD3D）、巨噬細胞（組織樣本C1QA）、B細胞（CD79A）、成纖維細胞（DCN）、內皮細胞（VWF、CLDN5）及上皮細胞（KRT18、EPCAM）。

4.細胞類型鑒定結果tSNE圖：

下圖就是原始的tSNE分類結果，共有18個類群，此時要結合第3步中Marker基因特異性表達的結果對Cluster進行合并。

5.細胞亞型分群圖：

該圖將0、1、2、3、4、9 Cluster合并為T細胞（CD3D）；將5、8、12 Cluster合并為巨噬細胞（組織樣本C1QA）；將11、13 Cluster合并為B細胞（CD79A）；16 Cluster為成纖維細胞（DCN）；14 Cluster為內皮細胞（VWF、CLDN5）；將6、7、10、15、17 Cluster合并為上皮細胞（KRT18、EPCAM）。

后續可以將自己關注的細胞亞型再次細分，并進行其功能性分析，為解讀生物學意義細節提供基礎，后續講解會詳細介紹。

綜上所述，通過標準化將數據過濾后通過PCA降維，并形成t-SNE可視化結果；降維后的矩陣進行細胞聚類分析，并計算出各類群的marker基因及表達量，以鑒定所屬的細胞類型。

細胞類型鑒定后就可以進行后續深層次的擬時序分析（Pseudotime）、及SCENIC分析。后續小編將一一講解哦~