在單細胞轉錄組測序分析專題前兩期的講解中，小編已經為大家介紹了數據的質控、標準化和聚類，以及細胞類型的鑒定，不知道大家是否還記得這個細胞類型鑒定的圖呢？

鑒定好細胞類型后，我們還可以對其進行一些功能性分析，如擬時序分析和SCENIC分析，對細胞的生物學意義進行一定程度上的挖掘。本期小編主要為大家介紹擬時序分析（Pseudotime Analysis）。

1、Q & A環節

Q1：我們為什么要進行擬時序分析？？

l 機體為響應各種應激，其細胞會從一種功能“狀態”轉變為另一種功能“狀態”；

l 當細胞在不同狀態之間轉變時，往往會經歷轉錄重組，導致一些基因被沉默，一些基因被重新激活，但純化這些瞬態細胞進行研究是很困難或不可能的；

l ScRNA-seq擬時序分析可以讓我們在不需要純化的情況下查看這些細胞狀態。

Q2：ScRNA-seq擬時序分析是什么？？

擬時序分析，即根據不同細胞亞群基因表達量隨時間的變化情況，構建細胞譜系發育，但這里的時間并不是真時間，而是一個虛擬的時間，是指的細胞與細胞之間的轉化和演替的順序和軌跡。

l 即使在同一個樣本中，也會存在多種不同的細胞形態。因此，不論測定了多少樣本，我們都可以采用擬時序分析對樣本中的細胞轉化和變化進行描述。

Q3：擬時序分析用的工具是啥？它能進行哪些分析？

l Monocle是用于ScRNA-seq擬時序分析的經典工具（R包），目前已更新至3版本；

l Monocle是使用算法來學習細胞狀態轉變過程中每個細胞必須經歷的基因表達變化序列，一旦了解了基因表達變化的整體“軌跡”，Monocle就可以將每個細胞放置在軌跡中的適當位置。

l 我們可以使用Monocle中的相關分析工具做Beam分析（Branch Expression Analysis Modeling），揭示重要的基因和細胞。

（算法參考文獻：Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories.）

2、烈冰擬時序分析工作流搭建

3、擬時序分析結果解讀

對于擬時序分析來說，研究某一特定細胞類型的轉化，如M1/M2型巨噬細胞極化、CD8⁺ T細胞激活和耗竭等等，往往具有一定的生物學意義。這里小編通過對上期T細胞進行亞群鑒定，以CD8⁺ T細胞亞型為例進行擬時序分析（圖1）。

圖1 CD8⁺ T細胞亞群鑒定流程

（1）CD8⁺ T細胞樹形結構軌跡

圖2 CD8⁺ T細胞樹形結構軌跡

圖中每個點代表一個細胞，具有相似狀態的細胞被聚到一起，每個分支點代表一個可能的細胞生物學過程決策點（該例圖中只有1個分支點）。圖2展示了CD8⁺ T細胞每個cluster在偽時間軸上的分布，不同顏色代表不同cluster。我們這邊通過對每個cluster進行細胞類型鑒定，初步將cluster 2/3/6鑒定為記憶T細胞，cluster 7鑒定為Na?ve T細胞。

（2）CD8⁺ T細胞所處分化時間軌跡

Monocle基于離默認偽時間軸起點的遠近，將細胞排布如圖3所示。在該圖中顏色越深代表默認的起點，顏色越淺表示離偽時間軸起點越遠。注意：這邊的起點是monocle算法計算出來的，而非實際真正的起點。

圖3 CD8⁺ T細胞所處分化時間的軌跡圖

以該例圖為例，我們結合每個分支（共3個分支）中的cluster類群是否高表達CD8⁺ Na?ve T細胞相關Marker（如LEF1、SELL和CCR7等）, 耗竭性T細胞相關Marker（如LAG3、HAVCR2、CD27、TIGIT等），以及細胞增殖相關Marker（如MKI67、TOP2A、CCNB1等），將起始狀態鑒定為Na?ve T細胞，終末狀態為耗竭性（Cell fate 1）和增殖型（Cell fate 2）T細胞。

（3）Beam分析

確定了分化起點后，Monocle可以模擬出每個細胞所處的分化時間，并尋找隨著分化時間逐漸升高或降低的基因表達熱圖和分布圖，即Beam分析。圖4將Top200差異基因聚成4類，展示了pre-branch向cell fate1和cell fate2狀態分化相關的命運決定基因。圖5展示了與細胞增殖相關的基因，如MKI67和TOP2A在cluster 5中高表達，提示cluster 5作為CD8⁺ Na?ve T細胞終末分化狀態是一種增殖型細胞（Proliferating）。除此之外，如果有特別關注的基因也可以基于關注的基因進行繪制。

圖4 擬時序Beam分析基因表達熱圖

圖5 擬時序Beam分析基因表達分布圖

總的來說，通過對CD8+T細胞亞型進行擬時序分析得到了CD8+ T細胞的分化軌跡，進行Beam分析可以幫助得到與狀態分化相關的命運決定基因。以上，就是本期單細胞測序數據分析——擬時序分析的全部內容，敬請期待下期SCENIC分析的精彩內容～