前幾期小編已經連續分享過很多篇單細胞測序的高分文章，并介紹了單細胞分選平臺的選擇對某些類型細胞捕獲的重要性。本期開始，小編將從數據預處理、標準化及聚類、擬時序、SCENIC分析等幾個方面放送大量數據分析干貨，帶領大家深入探索單細胞測序的奧秘。

本期小編主要對scRNA-Seq的數據預處理（質控、細胞數量判斷、多樣本數據合并）進行介紹。

一、數據預處理流程

上海烈冰科技作為國內一家同時擁有BD Rhapsody和10X Genomics雙分選平臺的測序服務商，針對不同的分選平臺、建庫方法，實戰總結搭建出不同的數據預處理工作流程。

BD Rhapsody數據預處理流程

10× Genomics數據預處理流程

二、工具介紹

SCFastp——采用fastp軟件對下機原始數據進行過濾過短、低質量序列及接頭處理等操作。

UMI_tools_whiteList——采用UMI-tools的whiteList功能建立真實細胞條碼的白名單，結合BD scanner記錄的捕獲細胞來獲得細胞數。

UMI_Tools_Extract——利用UMI-tools的extract功能根據上游工具得到的細胞條碼白名單提取測序序列，并對這些序列進行質量過濾。然后使用STAR軟件將過濾后的測序序列比對到參考基因組。

UMI_Tools_Counts——利用UMI-tools的FeatureCounts功能統計細胞內基因表達水平。

ScCountsCombine——BD Rhapsody多樣本數據合并的工具。

CellRangerCounts——10× Genomics的數據采用cellranger count（3.1.0版本）工具進行細胞基因表達水平統計。

CellRangerAggregate——10× Genomics的數據采用cellranger aggr（3.1.0版本）工具進行樣本數據合并。

三、結果評估

1. 質控：

單細胞測序產生數億的結果序列，不可避免的會出現低質量的測序結果，存在各種情況的序列污染。因此序列過濾及質量評估就變得極為重要。

序列質量主要通過測序質量值Q20/Q30的占比來表征，即堿基測序結果的錯誤率在1% / 0.1%以下的比例。理想的測序結果reads的堿基質量均高于30。

2. 細胞數量判斷：

主要是對細胞數量、基因表達量、測序質量進行整體描述。

1) 過濾標準：

由于細胞破碎后游離RNA會釋放到環境或微孔中，并且測序中也會存在一些死細胞，導致數據存在background值。因此，我們需要設定一定的標準來過濾掉假細胞或死細胞。

以10× Genomics為例，細胞數量判斷主要通過分析UMI Counts-Barcode曲線斜率拐點，當存在多個斜率拐點的時候，結合預期UMI=500時的細胞數量進行過濾。當第一個斜率拐點低于UMI=500的時候，選擇UMI=500作為細胞的判斷的標準；否則，選擇和預期細胞數量最為接近的拐點作為細胞判斷的位置。這樣我們能夠有效獲得真實的并且在基因數量上可以分析的數據。

2) 定量reads數、基因表達量及細胞數量：

a) Mean Reads per Cell：以捕獲5000個細胞、100G的測序量為標準，每個細胞的reads數大約在50k左右；

b) Median Genes per Cell：每個細胞的基因中位數取決于樣本的細胞類型，例如在成熟B、T、粒細胞數量較多的組織中，由于這些類型細胞表達的基因數普遍較少，導致基因中位數較低。而像腫瘤組織、或者體外培養的干細胞/類器官組織，它們的基因表達數較高，甚至可以超過1W，這就導致該類樣本基因中位數非常高。因此，我們確認細胞數量以及基因中位數時，需考慮實際組織的細胞類型組成情況。

c) Fraction Reads in Cells：每個樣本過濾后細胞的reads數占總reads數（含背景）的百分比，反映的是測序數據的利用率。該參數的理想值應達到80%以上。

3.多樣本數據合并：

Fraction of Reads Kept：多樣本進行數據合并時，各樣本根據Mapped Barcoded Reads per Cell數量計算出來的數據利用率。若各樣本間Fraction of Reads Kept數值相差很大，需要進行Downsample處理，以數據量少的樣本為基準將不同樣本中細胞測序深度標化到同一水平，從而避免因測序深度差異導致的基因檢測數量、基因表達水平的差異。

總的來說，單細胞測序數據分析的預處理會對讀取的序列進行過濾、接頭處理等質控工作；還會從細胞的基因表達數量、豐度及線粒體基因占比等方面對細胞進行過濾；數據合并時需要注意各樣本數據的利用率。

數據預處理完成后，接下來就要正式進入分析流程了。下期小編將為大家講解scRNA-Seq中數據標準化、降維及聚類分析。