在高通量測序領域，流傳著一句話，叫做“Junk in, junk out.”，這就意味著要想得到一個好的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，就需要對前期的每一步操作都進行嚴格的把關，包括樣本的制備、測序以及數(shù)據(jù)的前期處理等。在整個單細胞測序?qū)嶒炦^程中，前期樣本的選取以及單細胞懸液的制備是整個實驗成敗的第一步。當獲得單細胞懸液之后，如何精準的判斷細胞的質(zhì)量、監(jiān)控單個細胞的分選效果則顯得更為重要，因為這一步直接關系著最后測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量以及數(shù)據(jù)分析結(jié)果的好壞。因此就需要對整個實驗流程進行嚴格的質(zhì)控和記錄。

NovelBio使用的單細胞分選系統(tǒng)（BD Rhapsody）可以對實驗過程中從單細胞懸液質(zhì)量評估到Single Cell分選標記的每一個步驟進行質(zhì)控及記錄，包括單細胞懸液中細胞數(shù)量、活性的檢測，單細胞分選標記過程中細胞、磁珠的鋪板情況、細胞被磁珠捕獲標記的情況以及雙細胞的比例等，在獲取實驗過程中關鍵信息的同時，也有效保證了實驗結(jié)果的可靠性。

圖1 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)

1、 單細胞懸液質(zhì)量評估

細胞數(shù)量、細胞活性的精準判斷對Single Cell分選標記、建庫、下機數(shù)據(jù)的質(zhì)量都具有著決定性的作用。如若細胞計數(shù)偏高，將會影響建庫的成功率；計數(shù)偏低，則會顯著提高雙細胞的比例；而細胞活率過低，就會使測序數(shù)據(jù)的利用率大打折扣，因此把好單細胞懸液質(zhì)量這一關尤為重要。

BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)集成了熒光顯微成像系統(tǒng)，可以對不同熒光標記的細胞進行檢測并計數(shù)。在進行質(zhì)量評估之前，首先要將細胞的培養(yǎng)體系更換成上機所需的Buffer。在這個過程中，需要進行多次離心、重懸操作，Novelbio單細胞實驗團隊推薦采用水平轉(zhuǎn)子離心機來進行這步操作（下圖左）。這種離心機可以有效減少細胞在多次更換Buffer過程中的損失，尤其是對于細胞量較少的樣本來說，顯得非常有必要。更換完Buffer之后，還需要將細胞進行過篩操作，去除較大的細胞團，獲得較為純凈的單細胞懸液。

圖2 單細胞重懸、過篩操作

在更換完Buffer之后在實驗中，可以通過Calcein AM和Draq7對細胞進行染色，兩種染料分別標記單細胞懸液中的活細胞以及死細胞，37℃避光孵育后（下圖左上），將細胞懸液加入血球計數(shù)板（下圖左下），載入BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)中進行熒光顯微成像（下圖右），對細胞的狀態(tài)進行評估。

圖3 細胞染色并上機檢測

當BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)對染色后的細胞進行掃描并照相后，根據(jù)明場及熒光成像結(jié)果，可以對單細胞懸液中的細胞數(shù)量、活細胞比例進行計算，進而對單細胞懸液的質(zhì)量進行評估。結(jié)果如下圖所示，其中左上、右上、左下分別為同一視野下的明場、綠色熒光、紅色熒光結(jié)果，右下為數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，計算并獲得了細胞總數(shù)及活細胞比例。

圖4 細胞計數(shù)及活性檢測結(jié)果

2、 細胞鋪板

當單細胞懸液滿足鋪板要求后，就可以進行單細胞分選標記操作了，在這一步，主要用到的儀器和耗材有如下幾種，分別為BD Rhapsody單細胞分選儀（下圖左上），BD Cartridge單細胞分選蜂巢板（下圖右上），BD Rhapsody 電動移液器（下圖左下）。

圖5 BD Rhapsody單細胞鋪板設備及耗材

在單細胞的鋪板過程中，由于不同操作人員手法具有不可避免的差異，不同的液體流速將直接影響單細胞的入孔效果。因此BD Rhapsody分選平臺還專門配套了定制的電動移液器，其具有Prime Treat、Cell Load、Bead Load、Wash、Lysis、Retrieval多種操作模式，來對應各種不同的操作。通過已經(jīng)設定的程序來控制液體的流速，大幅度降低人為操作習慣帶來的差異，保證實驗操作的一致性。

圖6 BD Rhapsody單細胞分選定制電動移液器

根據(jù)已有的細胞計數(shù)結(jié)果，將單細胞懸液稀釋到合適的鋪板濃度后，就可以進行鋪板操作了。待細胞因重力落入蜂巢孔內(nèi)后，可以通過BD Rhapsody成像系統(tǒng)對細胞的真實入孔情況進行檢測，根據(jù)圖像結(jié)果可以清楚看到每個孔內(nèi)是否有細胞落入以及落入多少個細胞，統(tǒng)計并評估實際的鋪板效果。（下圖）。

圖7 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)細胞鋪板情況檢測

3、 磁珠鋪板及清洗

待細胞鋪板完成后，就需要往BD Cartridge蜂巢板中加入過量磁珠，來保證大部分孔內(nèi)都能夠落入磁珠（下圖左），隨后再用Buffer清洗去除多余的磁珠（下圖右）。整個過程同樣可以通過BD Rhapsody成像系統(tǒng)進行掃描，評估磁珠的實際鋪板情況，并統(tǒng)計分析得到細胞和磁珠落入同一孔內(nèi)的數(shù)量，獲得細胞的真實捕獲情況。

圖8 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)磁珠鋪板情況檢測

4、 細胞裂解及磁珠收集

當蜂巢孔內(nèi)同時落入細胞和磁珠后，接下去可以往BD Cartridge板中加入細胞裂解液對細胞進行裂解，使細胞內(nèi)的RNA與磁珠上的標簽進行結(jié)合，完成每個細胞內(nèi)RNA的捕獲和標記。這時，再將捕獲了RNA的磁珠進行回收，待所有質(zhì)控結(jié)果確認通過后就可以進行后續(xù)的RNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA第二鏈合成等實驗操作。而BD Cartridge板則需要再進行一次成像，獲得磁珠收集后的掃描圖，判斷磁珠是否已經(jīng)被有效收集。

圖9 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)磁珠收集后檢測圖

5、 實驗總結(jié)報告

根據(jù)每一步的質(zhì)控結(jié)果，烈冰科技（NovelBio）單細胞實驗團隊會根據(jù)單細胞分選的實驗結(jié)果生成實驗總結(jié)報告，判斷每一步驟是否通過質(zhì)控，并得到最終捕獲的單細胞數(shù)量以及雙細胞比例，對整個實驗進行總結(jié)評估。若所有過程通過質(zhì)控，實驗樣本即可進行下一步實驗操作。

圖10 實驗總結(jié)報告

6、 烈冰團隊助力單細胞研究

單細胞測序技術（Single Cell Sequencing）從一種新興的研究角度，借助已有的高通量測序手段，幫助研究者在腫瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境、發(fā)育學、免疫學以及其他領域中進行單細胞層面的數(shù)據(jù)解析，解決了Bulk Population Sequencing所無法解決的問題。這樣一個新的研究領域必然也需要足夠可靠的實驗手段來支撐。BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)為此提供了完善的硬件設備，保證了從單細胞懸液質(zhì)量評估到單細胞分選標記過程中每一個實驗步驟的精準質(zhì)控。NovelBio單細胞實驗團隊借助BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)，在實驗實施層面對單細胞測序結(jié)果的可靠性提供了強有力的保證。繼單細胞懸液制備之后，又在另一道關鍵關卡提供了可靠的支持，幫助研究者在單細胞測序領域收獲更多的成果。