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上期，小編剛剛為大家解讀了復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院常秀麗教授團隊關(guān)于重金屬鎘對神經(jīng)發(fā)生的研究。本期，常老師團隊再次帶來最新研究成果：“Single-cell RNA sequencing reveals adverse effects of paraquat on the fate commitment of murine neural stem cells”。本篇文章發(fā)表在Science of The Total Environment（IF=7.963）上，揭示了百草枯（Paraquat，PQ）對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。

烈冰Novelbio參與本研究中的單細(xì)胞測序工作，下面我們一起了解一下本文的研究思路和數(shù)據(jù)分析過程。

樣本信息

小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（mNSCs）的體外培養(yǎng)模型：

原代的mNSCs從C57BL/6小鼠中獲得，而后利用細(xì)胞培養(yǎng)（PQ處理或未處理）獲得P2代mNSCs細(xì)胞，取P2代細(xì)胞。

樣本分組：

對照組(PQ-)：處理組(PQ+) = 1：1

單細(xì)胞捕獲平臺：BD Rhapsody 平臺

捕獲的細(xì)胞數(shù)：PQ（-）組4833個細(xì)胞，PQ（+）組4962個細(xì)胞

技術(shù)手段

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序       細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)           免疫熒光技術(shù)

結(jié)果分析

1.mNSCs細(xì)胞類型鑒定

作者利用單細(xì)胞測序技術(shù)，在兩組樣本中分別獲得4833個細(xì)胞(PQ-)和4962個細(xì)胞(PQ+)，并劃分為17個Cluster，其中包括8個主要細(xì)胞亞型：未成熟神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、少突膠質(zhì)祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。

圖1 主要細(xì)胞亞型鑒定

2.PQ對mNSCs分化的影響

作者對細(xì)胞亞型分析發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，PQ（+）樣本中未成熟神經(jīng)元、浦肯野細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞分別增了18.7%、3.4%和1.7%，而星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞分別減少了16.7%和9.1%。進一步，通過細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光等技術(shù)驗證，作者發(fā)現(xiàn)隨著PQ濃度升高，mNSCs向未成熟神經(jīng)元和神經(jīng)母細(xì)胞數(shù)量減少，即PQ抑制了mNSCs向神經(jīng)元方向分化。

圖2 PQ處理后NSCs的分化歷程

3.PQ對不同細(xì)胞亞型特異性反應(yīng)

為了探究PQ影響mNSCs分化的機制，作者利用差異基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)PQ處理在多種細(xì)胞亞型中誘導(dǎo)抗氧化損傷基因表達(dá)，如抗氧化損傷基因（Mt1、 Mt3、Prdx6）、核糖體蛋白質(zhì)家族基因（Rpl34、Rpl34ps1和Rpl26）等均上調(diào)，而不同類型細(xì)胞差異表達(dá)基因的數(shù)量有所不同，尤其是差異下調(diào)的基因。

圖3 PQ對不同亞型細(xì)胞特異性反應(yīng)

此外，作者采用GO富集分析進一步評估了未成熟神經(jīng)元的特異性反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)PQ誘導(dǎo)Cst3、Prdx6、Mt3和Apoe等基因的表達(dá)并顯著富集了氧化應(yīng)激反應(yīng)，結(jié)合Pathway通路分析發(fā)現(xiàn)，PQ處理后細(xì)胞的神經(jīng)退行性疾病信號通路顯著增強，可能會通過p53信號通路引起細(xì)胞凋亡。

圖4 未成熟神經(jīng)元的GO分析

4.PQ對未成熟神經(jīng)元調(diào)節(jié)機制

為進一步探究PQ對未成熟神經(jīng)元的作用機制，研究者利用免疫熒光技術(shù)，發(fā)現(xiàn)隨著PQ濃度升高，mNSCs中的細(xì)胞內(nèi)和線粒體活性氧簇（Reactive Oxygen Species, ROS)增加，另外線粒體靶向抗氧化劑MitoTEMPO預(yù)處理減弱了PQ的抑制作用。這些結(jié)果提示PQ通過干擾線粒體氧化還原平衡而影響mNSCs的分化。

圖5 PQ處理對未成熟神經(jīng)元的影響

5.PQ處理對細(xì)胞通訊的影響

最后作者利用CellPhoneDB分析，通過配受體的表達(dá)水平探究了PQ對神經(jīng)細(xì)胞間通訊的影響，結(jié)果顯示PQ下調(diào)了大多數(shù)細(xì)胞類型中細(xì)胞間的通訊。此外在未成熟神經(jīng)元中，PQ顯著下調(diào)了PTN-PTPRS/PLXNB2的表達(dá)，這可能影響了未成熟神經(jīng)元的成熟。

圖6 PQ 處理后細(xì)胞通訊分析

總結(jié)：

本研究基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出了mNSCs的8種細(xì)胞亞型，發(fā)現(xiàn)PQ改變了mNSCs的分化，導(dǎo)致了神經(jīng)元減少和星形膠質(zhì)細(xì)胞增加，并揭示PQ可能是通過增加細(xì)胞和線粒體內(nèi)ROS來影響其分化，為更好地理解PQ的神經(jīng)毒性提供了新的理解。

原文鏈接

https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.147386

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