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烈冰助力|單細胞測序解析重金屬鎘Cd對神經的損傷不可逆轉 時間：2021-12-08

環境問題每況愈下：人類生產活動的增加、不規范處理污染物都給環境帶來了不小的負擔，這其中重金屬污染尤為嚴重。有大量的研究表明長期的鎘（Cd）暴露會對神經細胞產生毒性，但這其中機制尚不清楚。

針對重金屬對細胞神經毒性的研究，烈小冰客戶——復旦大學公共衛生學院常秀麗副教授課題組在Food and Chemical Toxicology(IF=6.023)上發表了題為“Single-cell RNA sequencing of mouse neural stem cell differentiation reveals adverse effects of cadmium on neurogenesis”的文章，從單細胞水平上揭示鎘（Cd）對神經干細胞（NSCs）的分化具有毒性作用。

烈冰Novelbio參與本研究中的單細胞測序工作，下面我們一起了解一下本文的研究思路和數據分析過程。

一、樣本信息

樣本處理：原代的小鼠神經干細胞（mNSCs）從C57BL/6小鼠中獲得，而后利用細胞培養（Cd處理或未處理）獲得P2代mNSCs細胞。

樣本分組：CdCl₂（+）：CdCl₂（-）= 1:1。

單細胞捕獲平臺：BD Rhapsody 平臺

捕獲的細胞數：CdCl₂(+)組4826個細胞，CdCl₂(-)組4825個細胞

二、技術手段

單細胞轉錄組測序 細胞培養技術 細胞活力檢測技術 免疫熒光技術

三、單細胞分析工具應用

細胞類型鑒定 subCluster分析 差異基因表達分析 GO/Pathway分析 細胞通訊分析

四、結果分析

1.mNSCs細胞類型鑒定

作者利用單細胞測序技術，分別獲得4826個細胞（CdCl₂(+)組）和4825個細胞（CdCl₂(-)組）并劃分為14個Cluster。利用Marker Genes判定分析，鑒定出7個主要的細胞類型，包括未成熟神經元(Immature neuron)，星形膠質細胞(Astrocyte)，神經母細胞(Neuroblast)，浦肯野細胞（Purkinje cell），少突膠質前體細胞（OPC），神經干細胞（NSC）和室管膜細胞(Ependymal)（圖1）。

圖1 細胞類型鑒定及主要細胞亞型鑒定

2.CdCl₂處理影響NSCs的分化

通過細胞亞型的定量分析，作者發現相比于未處理組，CdCl₂處理樣本中星形膠質細胞的數量增加了14.4%，未成熟神經元減少了10.1%（圖2A）；而后利用免疫熒光技術發現在P2代的mNSC中，超過90%的細胞顯示了與分化相關的蛋白（SOX或NESTIN）的陽性表達，表明P2代mNSCs具有多譜系定向分化潛能（圖2B）；進一步，研究者發現當用1.5(μM) CdCl2 處理后，GFAP（星形膠質細胞標志物）比例顯著增加，DCX（未成熟神經元標記物）比例顯著減少，然而當用0.75(μM) CdCl2處理后，只有DCX的比例顯著減少（圖2C,D）。表明不同濃度CdCl2處理也會影響NSCs的分化能力。

圖2 CdCl₂處理后NSCs的分化歷程

3.CdCl₂處理后的不同亞型細胞特異性反應

接著，作者探究了CdCl2處理對細胞特異性反應的影響，通過差異基因表達分析發現，CdCl2的處理顯著影響了不同亞型細胞中轉錄本的表達和差異基因的數量，進一步，通過GO分析發現，雖然Cd處理使得未成熟神經元減少，但與其相關的功能條目顯著上升（參與細胞鋅離子穩態和銅離子解毒的基因表達上調），而與星形膠質細胞相關的GO條目卻顯著減少；Pathway分析發現，在多種細胞亞型中，大量的差異表達基因在核糖體通路中顯著富集，而ERK/MAPK信號通路并不豐富（圖3）。

圖3 CdCl₂處理對不同亞型細胞特異性反應

4.CdCl₂處理對細胞通訊的影響

細胞通訊方面，作者利用CellPhoneDB分析，發現當用CdCl2處理后，不同亞型細胞間的通訊減少（圖4A)；進一步利用韋恩分析，發現了505對配受體關系只在對照組樣本中表達，而CdCl₂處理樣本中僅存在49對配受體關系。另外，與未成熟神經元數據聯合分析發現，67對配受體關系在兩組樣本中均有表達，而30個配受體關系對僅在對照組中表達（圖4B）。其中與未成熟神經元發育相關的BAF6表達下調，而BAF7表達上調（圖4C)。