大家好！又見(jiàn)面啦！我是你們的烈小冰，今天給大家?guī)?lái)一篇干貨中的干貨，講講單細(xì)胞測(cè)序中至關(guān)重要的一步——單細(xì)胞的分離。

上次跟大家聊的細(xì)胞消化懸浮方案反響不錯(cuò)，各位老師都比較認(rèn)可，銷(xiāo)售部同事訂單增加不少，BOSS也給加了雞腿。今天烈小冰再次請(qǐng)到了平時(shí)神龍見(jiàn)首不見(jiàn)尾的烈冰實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)ACE Mr.Wang跟大家再深入地多聊一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)的具體操作問(wèn)題。

上一回我們按照研究方向進(jìn)行了分類(lèi)和舉例，今天我們更細(xì)致一點(diǎn)，Mr.Wang以親自上手做過(guò)的一些樣品為例，按照不同組織/細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技巧分享。

1. 肝臟：研究領(lǐng)域?yàn)楦伟⒏窝准跋愿闻K疾病，代表性物種為人、大/小鼠等。

肝臟可能是目前單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域的一個(gè)重要分支，畢竟我國(guó)乙肝、丙肝及相應(yīng)肝癌的患者數(shù)量確實(shí)太多了。無(wú)論是SCI文章還是中文核心期刊文章，大多數(shù)protocol都是很相似的，100-200 IU/ml的II型膠原酶，剪碎成小塊（1-2 mm³），37℃水浴消化30 min-4 h。根據(jù)自己實(shí)測(cè)的人肝癌和小鼠肝臟樣品結(jié)果來(lái)看，肝組織都很大，20 min的消化時(shí)間，就能拿到足夠多的單細(xì)胞了，畢竟細(xì)胞數(shù)量能夠達(dá)到10^5級(jí)別即可（What!不是說(shuō)上機(jī)1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞么？不要著急，后文在注意事項(xiàng)中會(huì)解釋具體原因）。Moreover，也有一些課題組應(yīng)用II+IV型膠原酶的混合液對(duì)肝臟組織進(jìn)行兩次灌注：i）第一次灌注，37℃預(yù)熱的D-hanks`液，從門(mén)靜脈進(jìn)入沖洗肝組織內(nèi)部的血液；ii）第二次灌注，II+IV型膠原酶，門(mén)靜脈進(jìn)入，通過(guò)流動(dòng)的消化液逐步“侵蝕”肝臟內(nèi)部血管內(nèi)皮以及肝細(xì)胞之間的細(xì)胞連接，使組織塊松散。后續(xù)使用組織剪和鑷子進(jìn)行物理撕裂分離，過(guò)70 um細(xì)胞篩。需要注意的是，整個(gè)灌注過(guò)程需要高壓注射泵來(lái)保持恒定的速度，而且，本方法一般適用于動(dòng)物原代肝細(xì)胞的分離，對(duì)于已經(jīng)切除的肝癌組織，灌注法不太適用。

注意！紅細(xì)胞裂解液！紅細(xì)胞裂解液！紅細(xì)胞裂解液！請(qǐng)實(shí)驗(yàn)人員務(wù)必提前準(zhǔn)備好新買(mǎi)的、質(zhì)量好的紅細(xì)胞裂解液！鑒于肝臟的解剖學(xué)和功能特性，其內(nèi)部含有大量的血液；而紅細(xì)胞對(duì)測(cè)序結(jié)果有一定影響，裂紅這一部分必不可少。因此，要注意的是裂紅試劑最好新買(mǎi)，根據(jù)離心后細(xì)胞團(tuán)中紅色細(xì)胞的含量/比例盡量一次處理完畢，不要裂紅兩次（細(xì)胞活性影響大），裂紅時(shí)間能短就不要長(zhǎng)（一般不超過(guò)5 min）。信了說(shuō)明書(shū)的邪，37℃裂紅5 min，操作2次，細(xì)胞活性下降很多。

2. 脾臟：研究領(lǐng)域?yàn)槊庖呦嚓P(guān)研究，代表性物種為大/小鼠。

脾臟作為最大的外周免疫器官，其內(nèi)部含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是進(jìn)行病原感染及基礎(chǔ)免疫學(xué)研究最常用的器官，也是我最喜歡的組織之二（另一個(gè)是腎臟）。操作方面滿滿的優(yōu)點(diǎn)，無(wú)論是剪碎后IV型膠原酶的消化（仍然是100-200 IU/ml，37℃，20-30 min），還是直接暴力研磨，都能拿到很多很好的單細(xì)胞懸液。用東北話講，抗霍霍。提醒一點(diǎn)，把脾臟離體后，立刻用銅網(wǎng)研磨，邊研磨邊加入完全RPMI-1640培養(yǎng)液（10% FBS），保證研磨過(guò)程中，單細(xì)胞會(huì)及時(shí)被培養(yǎng)液沖洗過(guò)銅網(wǎng)，而細(xì)胞團(tuán)塊以及一些成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮等不能通過(guò)銅網(wǎng)，銅網(wǎng)直徑一般是50-70 um，請(qǐng)自行換算成目數(shù)。

3. 腎臟：研究領(lǐng)域?yàn)閮?nèi)分泌、外周免疫損傷、腎炎等，代表性物種為人、大/小鼠病例模型。

由于腎臟外存在一層相對(duì)致密的膜，且解剖學(xué)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜（內(nèi)部有皮質(zhì)髓質(zhì)腎盂腎盞，外部還有一些腺體），制備單細(xì)胞懸液的時(shí)候，務(wù)必要用手術(shù)剪或者刀片把組織切得很碎，這樣后續(xù)消化得到的細(xì)胞中，對(duì)應(yīng)各解剖結(jié)構(gòu)的細(xì)胞類(lèi)型才足夠豐富。當(dāng)然，也跟一些老師交流過(guò)，初步剪碎后，通過(guò)暴力研磨也可以拿到足夠好的細(xì)胞（也很抗霍霍），后續(xù)可以試試。我們親測(cè)的結(jié)果，IV型膠原酶常規(guī)消化流程，可以拿到10^7級(jí)別且活性相當(dāng)高的單細(xì)胞懸液，很高效。

4. 外周血來(lái)源的單細(xì)胞：研究領(lǐng)域?yàn)榛A(chǔ)免疫學(xué)、免疫相關(guān)疾病、內(nèi)分泌相關(guān)疾病等，代表物種為人或者轉(zhuǎn)基因小鼠。

這部分實(shí)驗(yàn)，需要先區(qū)別2個(gè)名詞：白細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。血液通過(guò)EDTA管子（不能用肝素管！！！）抗凝后，直接裂紅處理，得到的細(xì)胞沉淀是白細(xì)胞；用淋巴細(xì)胞分離液得到的中間云霧層，是PBMCs。主要的差別在于白細(xì)胞包含嗜酸/嗜堿/中性粒等細(xì)胞，而PBMCs沒(méi)有。

隨后，我們可以開(kāi)始實(shí)驗(yàn)了。無(wú)論是直接裂紅，還是密度離心，拿到目的細(xì)胞群后，一般都是素質(zhì)三連（離心---棄上清---洗液重懸），然后計(jì)數(shù)+計(jì)活性，最后混勻稀釋到一定數(shù)量后上機(jī)鋪板。整個(gè)流程是最簡(jiǎn)單易行的了。

延伸一些，如果老師們的研究目的細(xì)胞群體是某一個(gè)亞群的細(xì)胞，比如造血干細(xì)胞，勢(shì)必會(huì)用幾種顏色的直標(biāo)抗體進(jìn)行FACS分選。這里會(huì)衍生出2個(gè)實(shí)際會(huì)遇到的難題：i）目的細(xì)胞數(shù)量太少，達(dá)不到10^5級(jí)別；ii）FACS分選后，細(xì)胞活性也可能不太好。

針對(duì)i）數(shù)量少的問(wèn)題，如果原始來(lái)源的細(xì)胞量足夠，可以通過(guò)多批次磁珠富集的方法，收集足夠多的細(xì)胞，比如肝臟內(nèi)部的巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）在組織內(nèi)含量很低，直接分離可能數(shù)量太少，建議通過(guò)磁珠富集的方法進(jìn)行。又或者Treg細(xì)胞，正常狀態(tài)下，僅占PMBSs總量的1%左右。乖乖用磁珠富集了pool在一起再做后續(xù)實(shí)驗(yàn)吧。而問(wèn)題ii），就比較困擾。FACS分選，看似是機(jī)器自己操作，但不同的操作人員的操作習(xí)慣、實(shí)驗(yàn)手法、以及機(jī)器配置對(duì)細(xì)胞活性都有影響。實(shí)在無(wú)法避免這一步驟的話，請(qǐng)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索穩(wěn)定的分選條件。另外，有一點(diǎn)是本人還未想通的。FACS分選時(shí)，標(biāo)記抗體越多，拿到的細(xì)胞同質(zhì)性越高，數(shù)量也越少；而問(wèn)題是，單細(xì)胞測(cè)序，本身就是要測(cè)細(xì)胞群體的異質(zhì)性。拿同質(zhì)性很高的細(xì)胞來(lái)做異質(zhì)性分析，理論上是可行的（萬(wàn)一里面確實(shí)有不同的細(xì)胞亞群呢，不就發(fā)達(dá)了么？！CNS不就隨便發(fā)了么？！），只不過(guò)聽(tīng)起來(lái)乖乖的，而且數(shù)量不夠這個(gè)問(wèn)題，一定會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。怎么辦？個(gè)人推測(cè)，如果目的細(xì)胞群體在總細(xì)胞中的含量并不是很低的話，其實(shí)可以直接拿總細(xì)胞群體去做實(shí)驗(yàn)，通過(guò)后續(xù)的tSNE分析來(lái)進(jìn)行亞群區(qū)分以及biomarker分析來(lái)確定每一群的marker gene。當(dāng)然，如果目的細(xì)胞亞群數(shù)量很少，可能占比10%左右，直接RUN總細(xì)胞確實(shí)會(huì)造成低豐度細(xì)胞亞群的細(xì)節(jié)損失。怎么辦？這時(shí)就需要靈活一點(diǎn)，少染幾個(gè)染色的抗體，多pool幾個(gè)樣本做混池，間接提高目的細(xì)胞亞群在總細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)比例。

請(qǐng)注意，以上推測(cè)僅僅是為了實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行的一些折中方式，可能在后續(xù)分析中會(huì)有一定的影響，還沒(méi)有最終的結(jié)論，請(qǐng)勿直接使用。如果造成不必要的損失，也就只能讓烈小冰把BOSS給的雞腿賠給你了。

最后解答一下前面預(yù)留的問(wèn)題：

不是說(shuō)上機(jī)1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞么？怎么又需要提供10^5級(jí)別的細(xì)胞？

提供的總細(xì)胞量與實(shí)際上機(jī)細(xì)胞量，是兩個(gè)概念。老師提供了總細(xì)胞，需要經(jīng)過(guò)幾次buffer的素質(zhì)三連（沉淀—棄上清—重懸），又有可能被裂紅，還要過(guò)細(xì)胞篩去除細(xì)胞團(tuán)塊。這一系列操作，會(huì)丟失大量的細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)手法的穩(wěn)定性，在這一步就體現(xiàn)出來(lái)了），而且這些丟失無(wú)論是用何種平臺(tái)都是無(wú)法避免的。因此，如果最初老師提供的總細(xì)胞量低于10^5這個(gè)數(shù)量級(jí)，一系列操作后可能無(wú)法滿足1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的上機(jī)要求。這時(shí)候就只有兩個(gè)選擇：i）直接上機(jī)，硬做；ii）通過(guò)sample label抗體和其他樣品進(jìn)行pool樣混合上機(jī)，最后通過(guò)數(shù)據(jù)分析來(lái)區(qū)分（套路等同于NGS的樣品間INDEX）。

好了，今天的單細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)技術(shù)分享就到這里，烈小冰去吃雞腿了，非常感謝Mr.Wang誠(chéng)意滿滿的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)分享，我們下期再見(jiàn)！

烈小冰受同事之托，對(duì)前幾日為烈冰上門(mén)做實(shí)驗(yàn)的人員提供包宿的同學(xué)表達(dá)感謝，跟烈冰一起犧牲休息時(shí)間完成單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)真的辛苦了！也非常感謝對(duì)烈冰的信任，將重要的項(xiàng)目托付給我們，烈冰定不會(huì)讓你們失望！