前方高能！單細胞測序實驗人員請迅速集合！迅速集合！

上回說到，走在生命科學研究前沿的急先鋒們，已經了解了單細胞測序在各自研究方向上的應用與價值，正摩拳擦掌準備大干一番，卻遇到了重重障礙。今天，我們就來聊一聊單細胞測序第一個“攔路虎”----單細胞消化與懸液制備，以及實驗過程中潛在的那些“坑”。

目前，單細胞測序的主要應用領域為人類醫學、神經生物學、遺傳生殖、干細胞等研究領域，涉及到的主要樣品類型十分廣泛，但根據其來源，可分為如下幾個大類：1）腫瘤組織，如肝癌、胃癌、乳腺癌等；2）實體組織來源的原代分離細胞，如腦神經元、腸道組織來源的上皮及干性細胞等；3）血液來源的某些細胞亞群（一般可以通過不同biomarker進行FACS分選），如通過5色標記的造血干細胞群體；4）干細胞誘導分化/重編程相關的細胞樣品。

如何根據自己課題的方案設計及樣品類型，選擇合適的單細胞制備方法，是事關成敗的第一要素！（生信分析的同學先冷靜一下，沒說你們不重要，畢竟好的樣品通過好的測序技術得到好的RAW DATA才能發揮你們的生信優勢對不！）CNS文章里的方法學，寫的都很(bu)經 (xi) 典(zhi)，看了之后還是一頭霧水。質量濃度單位還是活性濃度單位？That is a question.

因此烈冰的實驗團隊決定自己動手做一批動物實驗，摸索并優化出一套更適用的單細胞懸液制備方案。

l 實驗目的：比較不同類型膠原酶消化針對不同類型組織的消化效果，摸索出適用于小鼠不同組織器官（如心、肝、脾、肺、腎和腦）的消化條件。

l 實驗材料：剪刀、鑷子等器械需提前滅菌處理，RPMI-1640，FBS，D-Hanks`緩沖液(也可以換成含有Ca²⁺的HBBS)。膠原酶I/II/IV/V（具體類型及對應貨號如下圖）。

l 實驗方法：以肝臟、心臟為例，進行演示，詳細流程及注釋事項如下圖所示。

注釋事項：

① 解剖小鼠，取其具體靶器官時，一般采取斷頸的方式，優勢是處理快速、方法通用，但會引起體內局部（尤其是胸腔）內凝血，對心臟、主動脈和肺等組織有一定影響；解剖過程，務必快速準確，盡量減少細胞活性的損失；

② 沖洗過程，一般采用預冷的生理鹽水/PBS/D-Hanks`液/RPMI-1640等液體。此步驟注意兩點：預冷+維持細胞活性的“液體”。一般情況下，建議RPMI-1640添加FBS至10%終體積（其實就是完全培養液）。也有老師用終濃度1-5%的BSA，其實作用都是為了提高細胞懸液制備過程中的細胞活性。

③ 剪碎過程，注意兩點：快速+越小越碎越好。可以準備一次性的平皿，提前注入5-10 ml預冷的完全培養液，在預冷環境中剪碎組織。

④ 膠原酶消化，這一步注意事項較多。首先，明確適用于該組織的膠原酶，詳細情況見上面表格；一般情況下，IV型最通用，但特殊類型的組織用單一類型的酶效果更好；另外，根據研究目的，如果樣品所處微環境組織類型復雜，可以配成混合型的膠原酶，如II+IV型；第二，使用終濃度，我們整理了20+的CNS文章，發現有作者用質量濃度mg/ml，也有的用活性單位濃度UI/ml，考慮到各公司貨品單位質量對應的活性不同，建議以活性單位濃度UI/ml為基準。大多數的II或IV型膠原酶的使用濃度為100-200 UI/ml。最后，注意消化時間。一般情況下，膠原酶在37℃條件下活性最強，消化時間為20-30 min；也有文章在處理腫瘤組織時，消化4 h甚至過夜。不敢多想，深表懷疑。另外，也有老師喜歡用4℃消化過夜的方式，細胞數量和活性也都還不錯，可以嘗試，但可能不會通用于所有類型的組織。

⑤ 終止酶的消化，一般來說都是加入血清的。但是，由于膠原酶本身不受血清影響，因此，只能采用離心—棄上清—加培養液重懸的“素質三連”來洗去殘留的膠原酶。至于細胞碎片，這一步基本上都是通過低轉速短時間離心的方式進行的，基本上300 g，5 min即可。既保證活細胞離心收集，又保證細胞碎片懸浮在上清中被棄掉。如果，老式離心機只能調節轉速（rpm），沒有g這一選項的話，一般情況下是1000-1500 rpm。

⑥ 紅細胞裂解，這一步其實很糾結。先說結論，該裂還是要裂的，不過盡量在初步分離細胞的時候把紅細胞去除干凈。不過，像心臟和肝臟這樣的組織，本身紅細胞含量就超級高，裂紅在所難免。至于為什么糾結，因為有些細胞類型被裂紅試劑處理后，會發生聚集并收縮在一團，用移液器輕微的吹打不容易將其分開，會影響后續實驗的單細胞得率。

⑦ 最終，在檢測細胞活性/數量的時候，再啰嗦幾句。以本人十幾年的實驗經驗（暴露年齡了），要么走經典路線，光學顯微鏡+細胞計數板+臺盼藍；要么走高科技路線，活/死細胞熒光染料染色后全自動計數儀操作。這里不建議用臺盼藍染色，再全自動計數的儀器，貴不貴不是最重要的，關鍵是不準確，且批次間可重復性太低，低到你崩潰。明明鏡下觀察活性相當客觀，為何全自動說細胞都掛了呢，不思其解。問了周圍的小伙伴，以及銷售器材的一些朋友，確實也有不少人碰到過這一情況。

最后，給大家提一些單細胞懸液制備的注意事項：

1） 針對具體組織類型選對酶，以及使用濃度；多種類型組織共存，可配置混合型酶反應液；提前摸索活性濃度；

2） 酶干粉配置母液時要含有Ca2+離子才能激活活性；

3） 需要預冷的，需要室溫的，或者需要37℃的，都提前準備好。一般情況下，酶消化用37℃，其他分離過程用4℃減少活性損失（包括離心）；

4） 組織剪的越小，分離效果越好；

5） 離心機最好是帶g的，300 g+5 min通用全程；不帶g的話，1000-1500rpm即可，轉速過高，細胞活性會受影響，碎片也越多。

6）說了這么多，希望對大家的實驗有幫助。如果還有其他實驗技術疑問，可以關注我們的微信公眾號（烈冰生物），烈冰還會陸續分享更多關于單細胞測序的實驗技術和數據分析技巧。

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