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骨髓是構成終生血液生成和骨骼再生的主要部位。在骨髓微環境（BM niches）中，不同的間充質細胞、脈管系統和分化的造血細胞相互作用，以調節造血和間充質干細胞（分別為HSC和MSC）的維持和分化。但是，其細胞和空間組織仍存在爭議。近日，來自歐洲分子生物學實驗室（EMBL）等機構的科學家們結合單細胞和空間轉錄組學系統地繪制了小鼠不同骨髓造血微環境的分子，細胞和空間組成；分析了所有主要的骨髓駐留細胞類型，對其進行空間定位并闡明了促造血因子的來源；最后開發了一種RNA-Magnet算法，可以從單細胞轉錄組數據中準確地推斷出細胞的三維組織架構。
分析思路：
測序樣本信息：
8到12周C56Bl/6J雌性小鼠的股骨，脛骨，髖和脊椎骨
測序平臺：
10x Genomics系統，Illumina NextSeq 500
細胞分選平臺：
使用FACS進行分選：CD45-CD71+細胞（紅系祖細胞）
CD45-CD71-（非造血細胞）
研究結果：
1.通過scRNA-Seq鑒定和描述BM駐留細胞類型
研究者首先對小鼠的骨髓組織進行scRNA-Seq。為了同時捕獲高豐度和稀有的BM駐留細胞，在對小鼠總BM進行scRNA-Seq后，通過逐漸消耗豐富的細胞類型或從未消化的BM或酶消化的骨組織中對稀有細胞類型進行富集然后進行scRNA-Seq。
對得到的7,497個細胞進行t-SNE分析，共分出32個亞群，分別對應于不同的細胞類型或分化階段。利用marker基因的表達，GO分析等方法對細胞類型進行判斷，鑒定出主要的造血細胞類型，包括樹突狀細胞，嗜中性粒細胞，單核細胞，不同發育階段的T細胞和B細胞，以及CD45低表達并表達紅系細胞marker（如CD71）的紅系祖細胞。
圖1 通過scRNAseq鑒定BM駐留細胞類型
剩下的2%細胞為非造血細胞，不表達CD45和CD71。包括施旺細胞（Mog，Mag），平滑肌細胞（Tagln，Acta2），肌成纖維細胞，9種不同的Pdgfra陽性間充質細胞和兩個內皮細胞（EC）群體（Cdh5，Pecam）。其中內皮細胞包括表達Sca1（Ly6a）的動脈內皮細胞和表達Emcn的竇狀內皮細胞；間充質細胞包含軟骨細胞（Acan，Sox9），成骨細胞（Osteocalcin / Bglap，Col1a1）和幾種其它細胞類型，包括三個不同的成纖維細胞cluster，以及另外兩個與前人報道的SCF-綠色熒光蛋白（GFP）陽性和Cxcl12 –GFP 陽性的Cxcl12-abundant reticular（CAR）細胞表現出高度轉錄組相似性的細胞群體。值得注意的是，這兩個亞群差異表達脂肪細胞和骨細胞系的基因，因此分別將其命名為Adipo-CAR和Osteo-CAR細胞。其中Adipo-CAR細胞表達高水平的瘦素受體（Lepr），并與LepR–Cre細胞表現出高度的轉錄組相似性。相反，Osteo-CAR細胞表達較高水平的成骨細胞特異性轉錄因子osterix（Sp7）和較低水平的Lepr。另外，研究者還鑒定到一群表達Ng2和Nestin的間充質細胞，它們與前人描述的Ng2 + Nestin + MSC在轉錄組上具有相似性，將其命名為Ng2 + MSC。
最后，研究者利用偽時序分析構建了所有間充質細胞類型的分化軌跡，Ng2 + MSCs為分化起始細胞，下游分別為成骨細胞，CAR細胞，軟骨細胞和成纖維細胞。該研究中沒有發現破骨細胞，神經元和成熟的巨核細胞，這可能是由于對捕獲的細胞大小的限制。
圖2 BM駐留細胞類型的鑒定
2.通過結合單細胞和空間轉錄組對BM駐留細胞進行空間定位
研究者開發了一種改進的激光捕獲顯微解剖結合測序（LCM-Seq），根據竇和小動脈血管是否存在或根據距骨內膜的距離，從BM組織收集76個微解剖區域，利用LCM-Seq，對骨內膜，骨膜下，竇和小動脈，非血管的微環境組成進行了描述。
圖3通過結合單細胞和空間轉錄組分析對BM駐留細胞進行空間分配
為了評估新開發的空間轉錄組的方法，研究中比較了各微環境的marker基因在scRNA-Seq和相應的空間轉錄組學數據中的表達情況。成骨細胞基因在內皮細胞中選擇性富集，竇內皮特異的基因在血竇豐富的區域富集，而動脈內皮基因在小動脈富集。造血，施旺細胞和肌成纖維細胞的marker基因集合與任何微環境均無顯著相關性，表明這些細胞類型在微環境中的分布相對均勻，或者表明在LCM-Seq中數據覆蓋不足。相反，其余12個細胞群體的marker基因表達在各個微環境之間存在顯著差異。為了系統地評估這些BM細胞類型對候選微環境的優先定位，研究者使用CIBERSORT算法估算了空間轉錄組學數據中可以由scRNA-Seq定義的細胞類群的頻率。結果表明，空間轉錄組學與單細胞轉錄組學數據的整合，能夠將大多數鑒定的以及未知的BM細胞群體定位于不同的骨內膜，竇和小動脈以及非血管等微環境。
3. 細胞類型定位的驗證
為了確認通過LCM-Seq鑒定的BM細胞類型的空間關系，研究者利用針對特定細胞群體的marker基因組合，對骨切片進行了免疫熒光染色。
圖4使用免疫熒光法對CAR細胞亞型進行定位
基因表達分析表明，堿性磷酸酶（Alpl）和Cxcl12的表達可以區分Osteo-CAR（Cxcl12 + Alpl +），Adipo-CAR細胞（Cxcl12 + Alpl-）和Cxcl12-Alpl +細胞類型，例如成骨細胞，Ng2 + MSC和動脈EC。與小動脈marker基因Emcn的共同染色顯示，中央BM中的Cxcl12 + Alpl- Adipo-CAR細胞主要包被在小動脈中，與LCM-seq結果一致。相反，中央BM中的Cxcl12 + Alpl + Osteo-CAR細胞通常表現出非動脈定位和高度網狀形態。重要的是，在Sca1 + GFPdim小動脈的附近也經常觀察到Cxcl12 + Alpl + Sca1low的Osteo-CAR細胞，其中GFPhigh的Osteo-CAR突起密集地覆蓋了小動脈血管。這些結果證明了Osteo-CAR細胞的非竇性定位，并且定性地證實了這些細胞定位于小動脈和非血管區域，與LCM-Seq預測的結果一致。
圖5 使用免疫熒光法對其他間充質細胞進行定位
接下來，研究者使用CD31，SM22，Pdpn，Pdgfr，Col1a1和Sca1作為marker，來特異性鑒定和定位平滑肌細胞（SM22 + Pdpn-），成纖維細胞（Pdpn + Pdfgr +），成骨細胞（Pdpn-Col1a1 +）和動脈EC。結果證明了LCM-Seq的方法識別未知的細胞類型如Adipo和Osteo-CAR細胞，并將其在BM中進行空間定位的能力。
4. 利用scRNA-Seq數據準確預測BM駐留細胞類型的空間關系
研究者編制了一份完整注釋的細胞粘附受體及其同源質膜或細胞外基質結合配體的列表，并開發了RNA-Magnet算法，通過細胞粘附分子的差異表達來預測BM的細胞類型特異性定位。為了研究RNA-Magnet算法是否能夠判斷BM細胞類型間的空間定位關系，研究者引入了四個微環境群體：骨內膜微環境的成骨細胞，竇內皮細胞，小動脈微環境的動脈內皮細胞和平滑肌細胞。模擬計算表明，BM細胞群體對不同微環境的粘附性，與它們的空間轉錄組學的差異定位程度密切相關，證明了RNA-Magnet算法利用單細胞基因表達數據預測細胞空間定位的能力。
圖6 利用RNA-Magnet從單細胞基因表達數據推斷細胞相互作用
5. 骨髓中細胞因子和生長因子的細胞和空間來源
發生在BM中的關鍵生物學過程被認為是由多種細胞因子和生長因子的協同作用共同介導的。然而，對于產生細胞因子的細胞及其在BM微環境中的空間組織和功能仍然知之甚少。為了在蛋白質水平上確認Adipo-和Osteo-CAR細胞的Cxcl12表達，研究者開發了FACS的策略來區分這些細胞類型，并使用基于FACS的index-scRNAseq進行了確認。對比分析表明，Adipo-CAR細胞為CD45-CD71-Ter119-CD41-CD51 + VCAM1 + CD200mid CD61low，而Osteo-CAR和NG2 + MSC高表達CD200和CD61。在所有BM細胞類型中，CAR細胞產生的不同細胞因子和生長因子最多，這表明CAR細胞是“專業的細胞因子產生細胞”。研究者根據這些觀察結果提出了一個模型，在該模型中，專業產生細胞因子的細胞的差異定位導致建立了特定的微環境。
圖7 BM中關鍵細胞因子的細胞和空間來源
6. BM細胞類型的細胞間信號相互作用分析
最后，研究者將RNA-Magnet算法應用于可溶性信號傳導介質（例如細胞因子，生長因子等）及其受體，獲得了潛在的細胞間信號傳導相互作用的系統概述。利用RNA-Magnet分析得到的網絡形成了兩個斷開的信號簇，分別由成熟的免疫或非造血細胞組成，表明免疫細胞和非免疫細胞優先在各自的分組內進行通訊，說明不同的BM生物過程是由來自不同局部微環境的特定組合信號介導的。
圖8 BM中信號傳導潛力的系統級分析
總之，研究者開發的新方法就能夠幫助揭示BM細胞的組成，即三維組織架構，以及細胞之間是如何進行相互作用的。研究人員利用該方法可以研究諸如白血病等血液疾病發生的分子機制，開發新型療法。除此之外，新方法還能在多種組織中應用，用來確定組織中細胞的空間架構，研究人類疾病的復雜病理學機制。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41556-019-0439-6
單細胞轉錄組測序專題
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