中南大學(xué)湘雅醫(yī)院范學(xué)工教授課題組通過(guò)高通量測(cè)序手段，對(duì)表達(dá)HBx基因的肝細(xì)胞中miRNA-mRNA之間的相互調(diào)控進(jìn)行研究，研究成果發(fā)表于World Journal of Gastroenterology，烈冰在該工作中提供了高通量測(cè)序和生物信息分析服務(wù)及技術(shù)支持。

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，俗稱(chēng)“癌中之王”。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有超過(guò)74.5萬(wàn)的患者因HCC死亡，對(duì)其發(fā)病機(jī)制、診斷方法和治療手段的研究更是如火如荼[1,2]。流行病學(xué)調(diào)查表明，長(zhǎng)期慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染是導(dǎo)致HCC的主要病因，這種情況在亞洲更為常見(jiàn)[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒X基因（Hepatitis B Virus X, HBx）在HBV相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，肝細(xì)胞中HBx基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白降解及凋亡[4-9]，但具體的分子機(jī)制尚有待闡明。miRNA作為一類(lèi)內(nèi)源性小分子RNA，參與基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。已有研究表明有多個(gè)miRNA家族，例如miR-122、miR-125、miR-199等，與HBV相關(guān)HCC的發(fā)生密切相關(guān)[10]。

本篇文章以“Integrated analysis of microRNA and mRNA expression profiles in HBx-expressing hepatic cells”為題發(fā)表于 World Journal of Gastroenterology雜志，研究團(tuán)隊(duì)來(lái)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院范學(xué)工教授課題組，NovelBio在該工作中提供了高通量測(cè)序和生物信息分析服務(wù)及技術(shù)支持。該研究對(duì)轉(zhuǎn)染HBx基因的肝細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）和miRNA測(cè)序（miRNA-Seq），并通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的分析繪制了miRNA-mRNA核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為HBV相關(guān)HCC的分子機(jī)制研究提供了新的思路和研究靶點(diǎn)。

Methods

研究者建立了可穩(wěn)定表達(dá)HBx基因的人類(lèi)肝臟細(xì)胞系L02，命名為L(zhǎng)02/HBx，作為實(shí)驗(yàn)組；以轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒的L02/pcDNA作為對(duì)照組，分別進(jìn)行mRNA-Seq和miRNA-Seq，篩選出L02/HBx組中發(fā)生差異表達(dá)的mRNA和miRNA。之后借助GO分析和KEGG Pathway富集分析來(lái)評(píng)估候選分子標(biāo)志物（Biomarker）的功能，并通過(guò)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建分析差異miRNA和mRNA的相互作用關(guān)系。

分析思路

Results

差異基因表達(dá)譜分析

首先，研究者通過(guò)比較兩組細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，在L02/HBx細(xì)胞中篩選出1243個(gè)差異表達(dá)的基因，其中742個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，另外501個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（Figure1A）。研究者接著分別對(duì)這兩組基因中上調(diào)和下調(diào)差異較顯著的20個(gè)基因做了聚類(lèi)分析（Figure1B）。

Figure1A. L02/HBx和L02/pcDNA細(xì)胞的RNA-Seq整體差異基因表達(dá)譜

Figure1B. 差異較顯著的20個(gè)上調(diào)基因和20個(gè)下調(diào)基因

從這些差異基因中，研究者進(jìn)一步鎖定了5個(gè)上調(diào)基因---GPR6、KLHL31、FOXC1、UGT1A7 和MAGEA4，以及4個(gè)下調(diào)基因---SLC22A14、PCOLCE、A2M和KIAA1522，這些差異基因分別參與了DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附、代謝進(jìn)程、腫瘤轉(zhuǎn)化等信號(hào)通路。研究者通過(guò)qPCR對(duì)這9個(gè)候選基因的表達(dá)進(jìn)行定量驗(yàn)證，定量結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致（Figure1C, D）。

Figure1C. 候選差異基因的qPCR驗(yàn)證

Figure1D. 測(cè)序結(jié)果與qPCR定量結(jié)果的相關(guān)性分析

GO/KEGG Pathway富集分析

為了闡明差異表達(dá)的基因與HBx相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，NovelBio團(tuán)隊(duì)協(xié)助研究者對(duì)1243個(gè)差異基因進(jìn)行了GO功能富集分析和KEGG Pathway富集分析（Figure2A，B）。

Figure2A.差異基因的GO功能富集分析

Figure2B.差異基因的KEGG Pathway富集分析

miRNA表達(dá)分析

完成對(duì)差異基因的分析之后，文章接著對(duì)miRNA的表達(dá)進(jìn)行差異篩選。結(jié)果顯示，與L02/pcDNA細(xì)胞相比，L02/HBx細(xì)胞中6個(gè)miRNA表達(dá)發(fā)生下調(diào)，16個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)（Figure3）。研究者對(duì)其中4個(gè)差異miRNA進(jìn)行 qPCR表達(dá)量驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。

Figure3. L02/HBx細(xì)胞與L02/pcDNA細(xì)胞之間發(fā)生差異表達(dá)的miRNA

miRNA和mRNA表達(dá)譜整合分析

考慮到通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖鎖定核心miRNA群具有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，研究者采用以下策略對(duì)L02/HBx細(xì)胞進(jìn)行miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建（Figure4A）。

Figure4A. miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建策略

通過(guò)專(zhuān)業(yè)miRNA分析軟件miRnada和TargetScan，NovelBio團(tuán)隊(duì)協(xié)助研究者成功預(yù)測(cè)出miRNA的潛在靶基因，然后結(jié)合靶基因群的表達(dá)模式（Figure1A），鎖定一系列顯著相關(guān)的miRNA-mRNA靶向關(guān)系。從這些關(guān)系中，研究者根據(jù)Degree值挑選出11個(gè)處于核心地位的miRNA，并繪制了miRNA-mRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Figure4B）。該網(wǎng)絡(luò)圖中，與miR340-5p形成靶向關(guān)系的基因數(shù)目最多，另外有幾個(gè)miRNA可通過(guò)組合的方式共同調(diào)控某些靶基因。

Figure4B. miRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

為進(jìn)一步縮小范圍，鎖定核心miRNA，研究者對(duì)這些靶基因進(jìn)行了功能富集分析，挑選出其中與腫瘤信號(hào)通路（譬如DNA復(fù)制、基因表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂等）密切相關(guān)的基因，繪制核心miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Figure4C）。由該圖可以推測(cè)，L02/HBx細(xì)胞中發(fā)生上調(diào)的miRNA，如hsa-miR-7-5p和hsa-miR-182-5p，可能抑制了其靶基因MEF2C和GLI3的表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；而L02/HBx細(xì)胞中發(fā)生下調(diào)的miRNA，包括hsa-miR-501-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-324-5p和hsa-miR-488-3p等，則由于表達(dá)量的降低減弱了對(duì)靶基因（如JAK1、MAPK1、STX3、BCL10等）的抑制效應(yīng)，這些基因的激活可能會(huì)在HBx相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的促進(jìn)作用。

Figure4C. 核心miRNA靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

肝癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，涉及一系列的基因和細(xì)胞因子，而miRNA參與的基因調(diào)控可能在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在該篇研究之前已有研究報(bào)道多個(gè)miRNA，譬如hsa-miR-338-3p和hsa-miR-29c等，與HBx相關(guān)HCC的發(fā)展密切相關(guān)[11]。但鮮少有研究者將視線(xiàn)聚焦到miRNA和mRNA之間的靶向調(diào)控和相互作用。該研究借助二代測(cè)序手段，結(jié)合深入的生物信息學(xué)分析，首次對(duì)相關(guān)miRNA和mRNA進(jìn)行了整合分析，繪制了miRNA-mRNA核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此項(xiàng)研究成果不僅有望揭示HCC細(xì)胞中HBx蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，還為其臨床診斷和治療提供了有價(jià)值的診斷標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)。

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