清明假期馬上就要到了，小伙伴們有沒有做好出游計劃呢~

我們都知道，清明節是中華民族數千年以來的重大春祭節日，掃墓祭祀，緬懷祖先。在這樣一個尋根問祖的最好時節，作為生物醫學領域的從業者，烈小冰也同大家一起在細胞層面追溯一下生物個體的起源，也算是應時應景。

今天烈小冰為大家介紹的文章由上海交通大學Bio-X實驗室于2018年12月份以“Molecular characteristics of early-stage female germ cells revealed by RNA sequencing of low-input cells and analysis of genome-wide DNA methylation”為題發表于權威期刊DNA Research，文章引用了烈冰自主研發的可變剪接算法ASD（Alternative Splicing Detector，網址：http://www.yizhishua.cn/asd/ASD.html）烈冰技術團隊也在其中提供了大量的數據分析服務和技術支持。

背景

在大多數多細胞生物中，包括哺乳動物，生殖細胞是一個新個體的起源，因此也承擔著將遺傳信息從上一代傳遞到下一代的職責。原始生殖細胞（Primordial germ cells，PGCs）是在發育初期階段建立的第一個生殖細胞群[1]。PGCs在經歷過遷移和性別分化之后，具有XX基因型的雌性胚胎PGC進入減數分裂的細胞前期I，然后在雙線期階段停滯，成為生發泡（germinal vesicle，GV）卵母細胞。在激素刺激下，GV卵母細胞完成第一次減數分裂，發育成為細胞中期II（MII）卵母細胞,又稱次級卵母細胞。

然而，最近的研究表明并非所有PGC都進入上述的分化途徑[2-4]。研究報道，通過免疫磁性分選可以從5日齡和成年小鼠的卵巢中分離出雌性生殖系干細胞（female germline stem cell，FGSC）。在培養超過15個月后，FGSC仍然表現出增殖能力和正常核型，并且可以繁殖出可育后代[5]。另外，在產后的大鼠，豬和成年女性的卵巢中也證實了FGSCs的存在[6-8]。

該文章中，研究者使用RNA測序（RNA-seq）技術，對新鮮分離的FGSC的轉錄組和基因表達網絡進行分析，并破解PGC，FGSC，GV和MII卵母細胞中基因表達的時空模式。這些研究對于更深入地了解雌性生殖細胞的發育過程和FGSC的分子特征至關重要。

文章思路:

1.分別對PGC，FGSC，GV和MII卵母細胞進行微量細胞的RNA-seq，獲得表達譜數據；

2.通過對不同發育階段的甲基化水平檢測，對表達譜數據進行驗證；

3.鑒定出與FGSC分化相關的關鍵pathway；

4.對不同發育階段的基因表達進行加權基因共表達網絡分析，鑒定出核心基因；

5.對不同階段的lncRNA表達進行動態分析，鑒定出核心lncRNA；

6.對不同階段的可變剪接模式進行分析，探索潛在分子機制。

結果展示:

1. 雌性生殖細胞在不同發育階段的轉錄譜分析

研究者分別對PGC，FGSCs，GV和MII卵母細胞進行了5-8個細胞的RNA-seq，以檢測不同階段雌性生殖細胞中基因的表達情況，最終在37,980個已知小鼠基因中檢測到平均17,805（47％）個基因的表達。特別是在FGSCs中，基因表達比例達到49％。為了探究這些基因表達譜是否與發育階段相關，研究者使用非監督層次聚類算法來對RNA-seq數據進行分析。結果顯示，這些雌性生殖細胞準確地符合發育順序，從PGC到FGSC，并且如所預期的那樣以GV和MII卵母細胞結束（圖1A）。主成分分析（PCA）的結果揭示了發育階段之間表達模式的差異（圖1B））。所有階段的基因表達的成對比較的結果也證明了階段特異性的基因表達模式（圖1C）。有趣的是，大多數差異表達基因（DEGs）可以聚集成反映階段特異性表達模式的四個不同階段，因此可能在雌性生殖系統發育過程中發揮關鍵作用（圖1D）。

圖1.不同階段細胞的轉錄譜分析

2. 雌性生殖細胞在發育過程中的全基因組甲基化模式分析

為了進行雌性生殖細胞發育的全基因組DNA甲基化分析，研究者首先對新鮮分離的FGSC進行MeDIP-Seq，并分析了PGC， GV卵母細胞和MII卵母細胞的全基因組DNA甲基化的最新數據。結果表明，PGC具有相對較低的甲基化水平。性別分化后，FGSC也維持較低的甲基化，同時增加甲基化并分化成GV和MII卵母細胞（圖2A），這與RNA-seq得到的基因表達數據形成呼應。為了明確新鮮分離的FGSCs與培養的FGSCs之間是否存在表觀遺傳模式改變，研究者對這兩個群體進行了全基因組DNA甲基化分析，可以觀察到二者之間顯示出非常相似的DNA甲基化模式（圖2B），并由染色體標度和Stra8基因座證實（圖2C）。接下來，研究者分析了新鮮和培養的FGSC基因組中CpG島（CGIs）的甲基化狀態，發現培養的FGSCs中超過95％的甲基化CGIs可在新鮮的FGSC中被重新捕獲（圖2D））。對共享的甲基化CGI進行了功能注釋，發現富集功能主要與體細胞發育有關（圖2E）。總之，這些觀察結果表明培養的FGSC的DNA甲基化模式幾乎與新鮮FGSC的DNA甲基化模式相同。

圖2.不同發育階段細胞的甲基化模式分析

3.雌性生殖細胞DEGs的pathway分析

為了探索雌性生殖細胞發育過程中涉及的生物過程相關pathway，研究者使用基于貝葉斯模型的聚類方法來分析從PGC到MII卵母細胞的DEGs，確定了13種重要的模型表達趨勢（圖3A），其中趨勢1和10表現出從PGCs到MII卵母細胞的逐漸下降趨勢，因此推斷其與FGSCs的自我更新有關。相反，趨勢8和24表現出從FGSC到GV卵母細胞的增加趨勢，表明這兩組與FGSC分化有關。有趣的是，趨勢1/10共享一個途徑PI3K-AKT（圖3B I），而趨勢8/24共享TGF-β途徑（圖3B II），提示這兩種途徑分別在維持自我更新和調節FGSCs分化中起著關鍵作用。 為了證實PI3K-AKT信號通路在FGSC自我更新和存活中的作用，研究者通過AKT抑制劑IV和染色實驗證實AKT抑制劑IV處理的FGSC中凋亡細胞和死細胞的比例增加（圖3C）。對于TGF-β途徑，先前的研究將BMP4鑒定為PGC分化的關鍵調節劑[32],表明TGF-β超家族可能在小鼠卵子形成過程中調節FGSC分化，該發現與通路分析的結果相匹配，進一步驗證了RNA-seq數據。

圖3. 雌性生殖細胞DEGs的pathway分析

4. 雌性生殖系發育的加權基因共表達網絡分析

為了研究雌性生殖細胞發育階段與特定基因調控模塊之間的共表達關系，研究者進行了加權基因共表達網絡分析（WGCNA），發現雌性生殖系發育涉及25個共表達模塊（圖4A））。在類似功能模塊合并后，獲得了四個復合模塊，這些模塊顯示了階段特異性的表達模式。GO富集顯示這些模塊涉及一些階段特異性生物過程，如RNA加工，細胞分裂和細胞周期（PGCs），有絲分裂細胞周期和核分裂（FGSCs），配子生成和有性生殖（GV卵母細胞），減數分裂染色體分離和程序性細胞死亡（MII卵母細胞）（圖4B）。然后研究者檢測了發育期間模塊表達的分布，發現PGC模塊在發育過程中逐漸降解，而從FGSC到GV卵母細胞或從GV到MII卵母細胞的轉變中的模塊顯示出急劇退化和持續激活（圖4C）。

研究者分析了模塊和發育階段之間的相關性（圖4D），證明小鼠雌性生殖系發育也涉及階段特異性共表達模塊。接下來，為了鑒定核心階段特異性調控基因，研究者構建了核心基因網絡，并篩選出一組核心基因：Ncapd2，INCENP，Rab5b，PSAP，GTPBP3和EIF4H（圖4E）。通過這些分析，研究者推測FGSCs可能與這些核心基因有關，并通過控制其有絲分裂進程進一步指導干細胞自我更新。

圖4. 雌性生殖系發育的加權基因共表達網絡分析

5.lncRNA的動態表達分析

為了追蹤雌性生殖系發育中長非編碼RNA（lncRNA）的表達，研究者鑒定出632個顯著差異表達的lncRNA。經過層次聚類分析，研究者發現，與蛋白質編碼基因一樣，這些lncRNAs顯示出非常獨特的階段特異性表達模式，表明它們在雌性種系發育過程中具有調節作用（圖5A）。

miRNA是哺乳動物發育和體內平衡的重要調節劑，lncRNA通過與miRNA的結合調節其相應的mRNA。本研究中，研究者使用了三個核心基因（Ncapd2，CDKN1A和Rab5b），兩個已知的生殖系標記基因（MVH和C-KIT）和一個干細胞相關基因（LHX1）構建交互網絡，獲得了功能特征性的lncRNA，包括XIST和MALAT1（圖5B，C）。使用單細胞RT-PCR，研究者在FGSC階段鑒定到XIST的表達（圖6D），這與RNA-Seq數據一致。值得注意的是，研究者發現ZFP783可通過miR-6963-3p與FGSCs中的MVH和CDKN1A相互作用。由于CDKN1A已被證實對維持FGSCs很重要（圖3C XII），因此揭示了ZFP783可通過miRNA海綿效應來對FGSC分化和有絲分裂細胞周期發揮調節作用。

圖5. lncRNA的動態表達分析

6.可變剪接的動態模式分析

在雌性生殖系發育過程中，研究者發現FGSCs的可變剪接（AS）發生頻率最高（圖6A），可能有助于FGSCs的自我更新和分化。在FGSC階段具有兩個或更多個轉錄物的已知基因的比例也顯示在圖6B中。

為了進一步研究FGSC特異性AS模式，研究者獲得PGC與FGSC和FGSC與GV卵母細胞之間的AS的交叉元件用于后續分析。通過調整P值<0.05，研究者在FGSC階段鑒定了698個AS事件（圖6C），其中內含子保留和盒式外顯子都是關鍵的AS模式。有趣的是，G蛋白偶聯受體途徑也參與到有絲分裂過程（圖6D）。根據以往的研究，研究者繪制出幾個核心基因（DTYMK，FHL1，CDK2，SYCP3和TBP）的AS類型（圖6E）。綜合這些結果，研究者推測動態AS模式可以影響有絲分裂相關的基因表達，繼而促進FGSC的特性形成。

圖6.可變剪接的動態模式分析

綜上，本研究系統地分析了PGCs，FGSCs，GV和MII卵母細胞的形態和分子特征。通過RNA-Seq對已知的RefSeq基因，已知的lncRNA，新的lncRNA和AS的動態模式進行研究，描繪出雌性生殖系發育和FGSC來源的卵母細胞形成背后的發育階段特異性和調節機制。這些發現對于研究卵細胞發育過程中的分子pathway和機制非常寶貴，并將在其他類型干細胞研究中得到更廣泛應用。

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參考文獻:

1. Saitou, M. and Yamaji, M. 2012, Primordial germ cells in mice, Cold Spring Harb, Perspect. Biol., 4, 59–66.

2. Bukovsky, A., Gupta, S.K., Virant-Klun, I., et al. 2008, Study origin of germ cells and formation of new primary follicles in adult human and rat ovaries, Germline Stem Cells. Humana Press, 450, 233–65.

3. De Felici, M. and Barrios, F. 2013, Seeking the origin of female germline stem cells in the mammalian ovary, Reproduction, 146, R125–30.

4. White, Y.A.R., Woods, D.C., Takai, Y., et al. 2012, Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women, Nat. Med. , 18, 413–21.

5. Zou, K., Yuan, Z., Yang, Z., et al. 2009, Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries, Nat. Cell Biol., 11, 631–6.

6. Zhou, L., Wang, L., Kang, J.X., et al. 2014, Production of fat-1 transgenic rats using a post-natal female germline stem cell line, Mol. Hum. Reprod., 20, 271–81.

7. Ding, X., Liu, G., Xu, B., et al. 2016, Human GV oocytes generated by mitotically active germ cells obtained from follicular aspirates, Sci. Rep.,6, 28218.

8. White, Y.A.R., Woods, D.C., Takai, Y., et al. 2012, Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women, Nat. Med. , 18, 413–21.