邦耀生物非病毒定點整合CAR-T技術（Quikin CART^®）治療復發難治性淋巴瘤的臨床試驗結果表明：87.5%（7/8）的患者獲得疾病完全緩解，5例無癌生存已超過1年，首例接受治療的患者已無癌生存2年！

一代代的科學家和臨床學者的堅持探索和仁心仁術，讓每位罹患癌癥的患者不再畏懼寒冬，這也是烈冰全力幫助科學家攻關科研和臨床難題的意義和初心。

那么究竟是什么成果讓小編熱淚盈眶呢？

我們先從幾個故事講起：

01 腫瘤軍團和免疫軍團的戰爭從未停歇

人體本身的免疫軍團時刻保持警惕，幫助抵御外來病原體的入侵并及時發現和清除人體內“叛變”的細胞，對癌細胞同樣也是如此，但免疫細胞為防止自己“權柄遮天，濫殺無辜”，也給自己建立了一套“剎車系統”，保證執行的消殺任務保持在正常范圍，不會“殺紅了眼”造成不必要的傷亡，因此剎車系統就需要不時來控制一下，也就是我們常說的免疫檢查點。   而腫瘤軍團也不是吃素的，它不僅會隱藏戰術，讓清除它的T細胞很難發現他，即使位置暴露后還會猛踩免疫細胞的剎車系統，讓T細胞不再追擊。

因此，自身免疫系統也亟需調整作戰思路，一舉殲滅腫瘤軍團：

①  T細胞重新找出腫瘤細胞（CAR-T療法）；

② 不受阻礙全力追擊腫瘤細胞（免疫檢查點抑制劑）。

^{圖片來源：百家號}

     02 CAR-T制敵“新策略”

嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法是一種新型過繼免疫療法。它將患者T細胞在體外進行基因改造，使T細胞表達識別腫瘤特定抗原的單鏈抗體和T細胞活化的信號結構域，經過體外擴增后回輸至患者體內，從而實現腫瘤的靶向殺傷。

圖片來源：搜狐號

但新療法依然存在一些問題亟待優化，如現階段的CAR-T制備大都通過慢性病毒感染的方式實現，這種通過隨機整合的方式將CAR序列插入到T細胞基因組中和病毒DNA的引入也可能帶來療效的打折和潛在的安全隱患問題。

     03 CRISPR/Cas9基因編輯技術加入戰場

    CRISPR-Cas系統是原核生物一種抵御外來入侵核酸的免疫系統，已被廣泛用于新藥開發、疾病治療、動物模型構建以及分子診斷等各領域的基因組編輯中。結合CRISPR/Cas9技術，讓CAR序列的隨機整合方式轉變為定向整合方式成為可能，已有多項研究利用該技術成功制備了定點整合型CAR-T細胞，那么如何解決使用病毒帶來的問題呢？

最好的辦法當然是，不用病毒，即非病毒的定點整合CAR-T！

但這在之前還只是個構想，還從未有研究團隊實現過~

      04 夢想終將照進現實

    2022年8月31日，烈冰生物合作伙伴華東師范大學生命科學學院張楫欽、劉明耀、杜冰、李大力團隊與浙江大學醫學院附屬第一醫院黃河、胡永仙團隊合作在國際著名科研期刊Nature（IF=69.504）上在線發表了題為Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL的研究論文，證明了開發的創新性非病毒定點整合CAR-T技術在治療復發難治性淋巴瘤的臨床試驗中具有出色的臨床安全性和有效性。另外值得一提的是，張楫欽、劉明耀、杜冰、李大力也是邦耀生物的核心管理團隊成員。

烈冰生物有幸參與了本研究中的單細胞測序工作，為研究團隊機制研究方面的工作提供了數據支持。

【關于該項研究思路及過程解析】

01非病毒定點整合CAR-T細胞的制備

首先，為提高大片段CAR序列在T細胞中的整合效率，團隊通過大量實驗摸索和優化，發現以同源臂長度為800bp的線性雙鏈DNA作為模板，可獲得最好的CAR-T整合效果，并利用AAVS1位點進一步制備了靶向CD19的定點整合型CAR-T細胞（AAVS1-19bbz）。與慢病毒感染CAR-T細胞（LV-19bbz）相比，盡管電穿孔過程會導致一些細胞損傷，但并不影響CAR-T細胞的增殖和高細胞活力，AAVS1-19bbz均能在體外和小鼠體內殺傷腫瘤細胞，證明了制備非病毒定點整合的CAR-T細胞的策略是可行的。

02非病毒PD1定點整合CAR-T細胞對腫瘤殺傷力

基于多項PD1敲除可以有效增強CAR-T細胞功能的前置研究，團隊將目光聚焦到開發非病毒PD1定點整合CAR-T細胞上來（PD1-19bbz），希望獲得增強型的非病毒定點整合CAR-T細胞。實驗發現在PD1位點，CAR序列的整合效率為20%左右（最高30.3%），且PD1-19bbz細胞的增殖能力要優于LV-19bbz，PD1下調并不會影響CAR-T細胞行使腫瘤殺傷功能。

為了充分了解PD1-19bbz細胞的特性，團隊使用慢病毒和 CRISPR-Cas9技術制備了PD1敲除的 CAR-T 細胞。將其與LV-19bbz、AAVS1-19bbz和PD1-19bbz三組對比發現，PD1-19bbz的CAR表達水平與其他樣本組相似，但PD1-19bbz細胞對高表達或低表達 PD-L1的腫瘤細胞表現出更強大且持久的殺傷效果，小鼠生存率得到顯著提高，說明PD1敲除與非病毒定點整合CAR-T細胞制備方法可以聯合提高抗腫瘤功能。

03 臨床試驗評估該方案安全和有效

在此基礎上，研究團隊開展了研究者發起的臨床試驗以評估該方法治療復發難治性非霍奇金淋巴瘤（r/r B-NHL）的安全性和有效性：8例接受治療的患者中，未觀察到CAR-T治療相關的神經毒性和2級以上的細胞因子風暴，其中7名患者（87.5%）在治療后的觀察期內實現了疾病的完全緩解（CR），有5名患者出現持久反應，PD1-19bbz 細胞在體內增殖并持續存在，所有患者的最佳客觀緩解率為100%。值得注意的是，PD1-19bbz在回輸劑量和陽性率較低的條件下也顯示出良好的療效，表明非病毒PD1整合的CAR-T細胞對r/r B-NHL具有很高的安全性和有效性。

04 單細胞測序為全面了解治療前后狀態的變化提供支持

為了進一步了解非病毒PD1整合的CAR-T細胞的特性，團隊利用不同方法制備了CAR-T細胞并進行了單細胞測序，對10個樣本（分組詳見下圖a）中獲得的63789個細胞進行了深入分析，通過CD8+記憶和功能障礙/細胞毒性marker gene將其分為2大類群，從記憶和功能障礙/細胞毒性基因表達情況來看，非病毒基因特異性靶向（PD1-19bbz、AAVS1-19bbz）的細胞中CD8+記憶細胞百分比更高。與AAVS1-19bbz細胞相比，PD1的敲除使PD1-19bbz細胞具有增強的免疫反應能力。

為探究PD1-19bbz細胞在回輸前后的特性，團隊進一步對3例患者不同治療時間節點的9個臨床樣本也進行了單細胞測序并獲得54774個細胞，數據分析結果顯示：回輸后CD8+CAR+細胞中記憶細胞相關基因持續表達(如SELL、CD27等），某些細胞功能障礙相關基因表達減弱（如ITGAE、CD38等），說明回輸后存續的CAR-T細胞傾向于維持記憶性細胞的狀態；此外，免疫反應相關的多個基因在預后好的患者樣本中富集；基因集富集分析 (GSEA) 表明，PD1低表達的CAR+細胞具有更高的增殖和免疫反應能力，這為全面了解PD1-19bbz回輸前后狀態的變化并解釋其臨床表現提供了數據支持。

【總結】

研究團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯系統,在不使用病毒載體的情況下成功制備了靶向CD19的PD1下調定點整合型CAR-T細胞，并通過臨床試驗證明了其臨床治療的安全性和有效性。進一步結合單細胞測序技術，證實了非病毒PD1定點整合CAR-T細胞具有更高比例的記憶性T細胞和更強的免疫反應能力。本研究對推動CAR-T技術的發展具有重大意義。

單細胞捕獲平臺：烈冰生物10X Genomics平臺

生信數據分析平臺：NovelBrain^®生信分析系統

數據分析工具：細胞聚類分析，Marker gene鑒定，GSEA分析，Qusage分析等

華東師范大學生命科學學院張楫欽副研究員為論文第一作者、共同通訊作者，浙江大學醫學院附屬第一醫院黃河教授為論文通訊作者，華東師范大學生命科學學院劉明耀教授、杜冰教授、李大力研究員為論文共同通訊作者。浙江大學醫學院附屬第一醫院胡永仙教授、華東師范大學生命科學學院楊佳璇碩士為本文共同第一作者。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05140-y

撰稿：烈冰市場部

文稿審核：原文作者團隊

排版：烈冰市場部