前列腺癌（PCa）是男性中最常見的惡性腫瘤，它的發生和發展與雄激素受體（AR）信號密切相關。雄激素剝奪療法（ADT）一直是局部晚期和轉移性腫瘤患者的主要治療方法。然而，盡管使用第二代抗雄激素藥物治療，如苯扎魯胺（ENZ）和阿比特龍，最初會限制腫瘤，大多數患者最終復發為轉移性去勢抵抗PCa（mCRPC）。

越來越多的證據表明，腫瘤微環境（TME）與 去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）有關，腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）是腫瘤基質中最豐富的細胞類型之一，呈現異質性與表型可塑性，在體外，iCAF（炎癥成纖維細胞）、myCAF（肌成纖維細胞） 和 apCAF （抗原呈遞類成纖維細胞）會根據培養條件進行相互轉化。然而，目前還不清楚CAFs 命運轉換和表型轉換是如何與疾病復發有關的。

烈冰生物合作伙伴中國科學院上海營養與健康研究所秦駿課題組聯合中山大學孫逸仙紀念醫院黃海以及中國人民解放軍陸軍特色醫學中心大坪醫院江軍團隊針對上述問題開展了系列研究，于近期在 Cancer Cell期刊發表了題為：Antiandrogen treatment induces stromal cell reprogramming to promote castration resistance in prostate cancer 的研究論文。烈冰生物參與了本研究中的單細胞測序和數據分析工作，下面我們一起了解一下本文的研究思路和結果解析部分～

發表日期：2023年5月

發表期刊：Cancer cell

影響因子：IF=50.3

“單細胞測序實驗設計”

實驗分組：

Pten基因敲除小鼠（無治療），4月齡；惰性前列腺腫瘤

Pten; Trp53雙基因敲除小鼠（無治療），3.5月齡；轉移性前列腺腫瘤

Pten基因敲除小鼠（2.5月齡去勢隨后2個月的ENZ治療）；對ADT部分敏感

Pten; Trp53雙敲除小鼠（2.5月齡去勢隨后2個月的ENZ治療）；去勢抵抗性前列腺腫瘤（CRPC）

采樣組織：小鼠前列腺

單細胞捕獲平臺：10X Genomics

主要技術手段：單細胞測序（scRNA-seq）、基因工程小鼠模型（GEMM）、小鼠造模（PDX）、 Bulk RNA-seq 、ChIP-seq 、ATAC-seq等

Novelbrain云平臺分析工具：

細胞聚類分析、subcluster分析、擬時序分析、差異基因表達分析、轉錄因子分析（SCENIC）、GSEA基因富集分析

【研究成果解析】

1 單細胞測序初步分析與細胞類型確認

研究者利用基因工程編輯小鼠，通過scRNA-seq來評估免疫、腫瘤和基質細胞的群體。為了保證后續分析的可靠性，研究者與烈冰的生信團隊對數據進行嚴格的質控，最終每個樣本平均得到6960個細胞，每個細胞平均檢測到2039個基因。通過細胞聚類分析，總共鑒定出11 個細胞大類。其中不同樣本中細胞類型的比例有明顯差異，表明了不同疾病階段的腫瘤內異質性。

非免疫細胞（CD45-）中，Pten; Trp53雙敲除小鼠（ADT治療，即CRPC組）中發生了上皮細胞和成纖維細胞-1數目的減少以及成纖維細胞-2數目的增加；免疫細胞群體（CD45+）中，Pten; Trp53雙敲除小鼠（ADT治療，即CRPC組）發生了中性粒細胞數量減少，并有單核細胞增多的趨勢，T 細胞組成的變化與小鼠前列腺的疾病狀態沒有明顯的相關性，支持小鼠PCa中的免疫抑制TME。

2 成纖維細胞重聚類鑒定出一個獨特的myCAF亞群

考慮到成纖維細胞的組成在Pten; Trp53雙敲除小鼠（ADT治療）中發生了較大的改變，研究者將成纖維細胞群體重聚類，得到5個亞群（c1-c5）。c1 和 c2 CAF類似于炎癥iCAF的特征、而c5 CAF 表現出肌成纖維細胞樣 CAF (myCAF) 的特征，c3 和 c4 呈現iCAF 和 myCAF 中間態的轉錄組特征，其中，c4和c5特異性出現在 Pten; Trp53雙敲除小鼠（ADT治療）組內，且c5群體特異表達Ptn。進一步的擬時序分析表明c4 和c5 CAF 源自c1-3 CAF。

使用Marker基因Col1a1，Ptn，Pdgfra區分CAF亞群，免疫熒光染色結果表明，c1-2和c4-5在使用ADT治療和非治療組中，占比存在顯著差異，PDXs造模實驗中也驗證了此結果，其中PDGFRα^- PTN⁺ COL1A1⁺ 代表的c4和c5 CAFs約占耐藥腫瘤中總CAFs的30%。

基于細胞分離、流式分選（FACS）、對分離CAFs的bulk-RNA測序、細胞共培養等實驗證明，與單獨接種或聯合接種c1-3 CAFs的PCa細胞相比，只有c5 CAFs對ADT顯著不敏感，因此作者將 c5 CAFs 命名為 CRPC-CAFs，而 c1-3 CAF 在后續研究中被稱為對照CAFs（C-CAFs）。

磁共振成像（MRI）分析顯示，CRPC-CAFs缺失導致的前列腺腫瘤平均體積減少約2-3倍，結果支持了CRPC-CAFs是導致CRPC的關鍵基質成分。

3 CRPC相關的SPP1+ myCAFs通過旁分泌激活ERK信號來抵抗ADT

為了明確CRPC-CAFs作用于PCa細胞的機制，作者進行差異表達基因聚類，分成6個cluster。有趣的是，Cluster3的基因在與CRPC-CAFs共培養時相對于C-CAFs明顯升高，通路分析表明Cluster3富集了參與MAPK-ERK（細胞外信號調節激酶）信號傳導的基因，基因集變異分析（GSVA）進一步證明了這一點。根據scRNA-seq數據篩選到了CRPC-CAFs特異的分泌因子Spp1，結合實驗驗證表明去除分泌的磷蛋白1（Spp1）完全消除了CRPC-CAFs引起的抗雄激素作用，表明Spp1基因敲除表達有利于前列腺腫瘤的治療。

通過PDX-313HR和PDX-WCSCR模型實驗方法，表明阻斷CAF衍生的SPP1會使PCa對ADT重新敏感。為了確定CRPC-CAFs的細胞起源，作者進行了譜系追蹤實驗，實驗表明了AR直接抑制了Tgfbr1啟動子的活性，AR被抑制后，釋放了TGF-β信號，將iCAFs轉化為SPP1+myCAFs。

4 TGF-β誘導的SOX4通過SWI/ SNF復合物依賴的染色質重塑促進CAF轉化

為了更好地理解ADT通過TGF-β信號通路形成CRPC-CAFs的機制，作者應用scRNA-seq數據，采用SCENIC算法，尋找CAFs狀態下的差異激活轉錄因子（TFs），選擇Sox11、Sox9、Sox4、Tbx15等并評估其功能，通過基因敲除實驗發現Sox4 基因具有促進胰腺癌腫瘤增大的功能，同時與ENZ和TGF-β1共處理時，Smad2在Sox4基因座啟動子區域的占用顯著增強。

轉錄組學分析顯示轉染表達SOX4的慢病毒導致了轉錄組的實質性變化使C-CAFs與CRPC-CAFs具有很強的相似性；此外，SOX4的上調導致了染色質可及性的深刻變化，表明SOX4通過基因組機制促進CAF極化，通過結合和表達靶點分析（BETA）整合mRNA-seq和SOX4 ChIP-seq，發現SOX4主要作為轉錄激活因子。

全文總結

研究團隊通過基因工程編輯小鼠、PDX小鼠等模型，利用單細胞測序技術，以及大量的功能實驗驗證，揭示了雄激素剝奪治療（ADT）誘導的SPP1+ myCAFs是驅動去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）發展的關鍵基質成分，并深入研究了該群CAFs的起源與作用機制。作者提出，靶向CAF極化或旁分泌機制結合已建立的內分泌抗癌治療具有治療潛力，并有可能改善晚期PCa患者的治療結果。

本研究詳細信息參見原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.05.016

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