單細胞轉錄組測序（scRNA-Seq）

已成為目前最炙手可熱的科研技術之一，在揭示細胞間狀態、轉變和細胞間差異表達中有重要的意義。目前已廣泛應用于腫瘤、神經、發育等領域。

2021 年 1 月，上海長海醫院任善成教授與加拿大多倫多大學 Housheng Hansen He 教授、復旦大學附屬腫瘤醫院王建華教授合作在 Nature Cell Biology 雜志發表了題為「Single-cell analysis reveals transcriptomic remodellings in distinct cell types that contribute to human prostate cancer progression」論文。

（圖片來源：Nature Cell Biology）

文章通過單細胞轉錄組測序技術，解析了前列腺癌腫瘤微環境的高度異質性，發現了臨床病理和影像學無法識別的微轉移灶，還揭示了癌細胞通過外泌體的方式馴化免疫細胞轉錄組使其表達腫瘤基因，這些都對前列腺癌治療靶點的確定和侵襲性腫瘤生物標志物的研發開拓了思路。

下文由負責這篇文章單細胞生物信息學分析的作者，來自烈冰生物的張博撰寫，主要針對單細胞測序如何應用于腫瘤研究，如何設計實驗樣本、分析研究數據等問題進行解析。

一、文章概覽

烈冰生物參與了單細胞測序中樣本設計和單細胞消化、分選測序實驗，以及數據分析、生物信息學意義挖掘的工作。

二、研究結果展示

通過對 Batch1 進行單細胞轉錄組測序，注釋細胞類型主要包括上皮細胞、單核-巨噬細胞系、T 細胞、內皮細胞、成纖維細胞、肥大細胞等主要群體。然后分別對每個大群進一步分析。

Fig.1 13 例前列腺癌樣本的單細胞研究概況

（圖片來源：Nature Cell Biology）

1. 與腫瘤預后相關的上皮細胞類型

通過拷貝數變異分析、腫瘤細胞的 marker 基因/信號通路相關性分析，將上皮細胞鑒定為 luminal types、cell-cycle 、basal/intermediate 類型；我們主要研究了這些細胞類型與臨床預后的關系，發現特異性表達細胞因子 CCL2 的 basal/int. 亞群與前列腺癌有較好的預后關系；而 cell-cycle 細胞亞群則與前列腺癌預后呈負相關。

Fig.2  上皮細胞與 maker 基因相關性打分情況

（圖片來源：Nature Cell Biology）

Fig.3  TCGA 預后關聯性分析

（圖片來源：Nature Cell Biology）

2. 單細胞測序發現腫瘤轉移潛在機制和微轉移灶

在 T 細胞的研究中，我們驚奇的發現，T 細胞竟然表達前列腺癌特異性基因 KLK3，深入挖掘分析多種類型的單細胞公共數據庫發現 T 細胞均表達相應的腫瘤標記基因的廣泛特征。

接下來，以 KLK3 為中心，進行了基因與亞群功能相關性分析、基因共表達網絡分析，發現 KLK3 與細胞外囊泡（EV）和外泌體 PSA 相關通路被激活，這提示我們腫瘤可能通過分泌 EV 介導 KLK3 轉移至 T 細胞并降低其殺傷功能，為了證明該途徑的可行性，我們反復通過流式分選、RNA 熒光原位雜交、免疫組化等驗證實驗，發現了表達 PSA/KLK3 的 T 細胞，進一步證實腫瘤細胞通過外泌體馴化 T 細胞使其表達與腫瘤轉移相關的腫瘤標記基因。

Fig.4  T 細胞表達前列腺癌特異性抗原 PSA

（圖片來源：Nature Cell Biology）

那 EV 轉移是否會影響附近淋巴結（LNs）以及影響程度如何呢？我們又設計了前列腺癌淋巴結轉移樣本（Batch2）進行單細胞測序，同樣地發現所有腫瘤樣本的 T 細胞普遍高表達 KLK3。

有趣的是，其中一例前列腺癌患者的 MRI 影像及術后病理均提示左右兩側髂外淋巴結為陰性，而 scRNA-Seq 細胞亞群統計顯示右側淋巴結組織中存在高表達 KLK3 的 T 細胞，提示這可能已經形成了「轉移前癌巢」結構；而左側淋巴結組織中不僅存在高表達 KLK3 的 T 細胞，還存在惡性上皮細胞，即左側淋巴結已發生了臨床無法識別的微轉移灶。

除了這一發現，我們還注意到 Batch2 樣本采用 BD Rhapsody 平臺進行單細胞分選時，我們分析存在一群中性粒細胞，而 Batch1 樣本采用 10X Genomics 分選平臺的數據中沒有分析到中性粒細胞的存在。

Fig.5  單細胞測序發現臨床和影像學無法識別的微轉移灶

（圖片來源：Nature Cell Biology）

3. 基質細胞的分析模式

我們從 signature 基因、pathway 和轉錄因子等多角度完整描述了基質細胞的高度異質性，并在內皮細胞（EC）中發現有一部分高表達腫瘤相關性成纖維細胞（CAF）的相關特征基因，將其命名為激活的內皮細胞（aECs）。通過細胞通訊分析，發現 aEC 與上皮細胞有強作用關系，提示其可能影響腫瘤的進展。

Fig.6  aEC 與上皮細胞有強作用關系

（圖片來源：Nature Cell Biology）

于是，重新設計 11 例不同時期前列腺癌樣本（Batch3），分選出內皮細胞進行單細胞測序，通過擬時序分析發現 aEC 細胞大部分均來源于 CRPC 樣本，其亞群占比隨腫瘤進展至 CRPC 而逐步升高，表明 aEC 細胞亞群與前列腺癌惡性進展為 CRPC 密切相關。

我們利用流式分選，證明了大部分 aEC 細胞亞群來自于 CRPC 樣本；通過共培養發現 aEC 細胞亞群能夠提高前列腺癌細胞的侵襲能力，這些實驗都證實了 aEC 這一細胞亞群在前列腺癌發生發展過程中起著重要的作用。

Fig.7  aEC 占比與前列腺癌惡性進展密切相關

（圖片來源：Nature Cell Biology）

三、總結

我們通過巧妙地實驗樣本設計、深入地 scRNA-Seq 數據分析和驗證實驗，闡述了前列腺癌淋巴結轉移的潛在分子機制，并發現了一群與腫瘤進展相關的新細胞亞型，對前列腺癌新型治療策略和預后指導具有重要意義。

我們整理了一些細胞群體數據收錄進 NovelBrain 單細胞瀏覽器中,方便大家搜索關注的基因。

您也可以登錄www.pradcellatlas.com網址，下載獲取本文中數據，進行數據分析。

烈冰生物具備先進的 BD Rhapsody 和 10x Genomics 單細胞分選平臺，以及 BD FACS Melody 流式細胞分選平臺

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