BD Rhapsody^TM單細胞靶向測序揭示FoxM1調控新型關節炎相關破骨細胞前體巨噬細胞的形成

破骨細胞（Osteoclasts ）具有獨特骨破壞能力，通過支持骨髓（bone marrow，BM）的骨重塑從而在維持骨骼穩態中起關鍵作用。此外破骨細胞也參與類風濕關節炎中病理性的關節炎骨侵蝕，其主要發生在滑膜侵入關節骨外表面的地方。但是目前對于BM和滑膜不同組織環境中破骨細胞的前體狀態研究并不明確，尚不清楚它們是否源自單核細胞的相同前體狀態。

2019年11月18日，日本大阪大學Masaru Ishii團隊利用BD Rhapsody?平臺鑒定到一種由FoxM1調控的新型關節炎相關破骨細胞前體巨噬細胞。其研究成果以“Identification of a novel arthritis-associated osteoclast precursor macrophage regulated by FoxM1”為題發表于《Nature Immunology》雜志。

下面小編為大家解析一下這篇文章的研究思路。

1.CIA小鼠的炎性滑膜中流式分選出功能性破骨細胞前體細胞AtoMs

研究者對膠原蛋白誘導的關節炎（CIA）發作1周的小鼠血液、BM和滑膜細胞進行了流式分選，得到在血液和BM中高表達的CX3CR1^loLy6C^hi細胞和僅在滑膜中存在的CX3CR1^hiLy6C^int 細胞群體，并提出其分化軌跡：血液（R1）中的CX3CR1^loLy6C^hi細胞遷移到滑膜（R2）中，然后原位分化為CX3CR1^hiLy6C^int細胞（R3），揭示關節炎中的破骨細胞僅起源于循環的骨髓來源細胞，而不是局部駐留的巨噬細胞。

此外，研究者還證明了完全分化的R3——CX3CR1^hiLy6C^intF4/80^hi細胞（R3’）在發炎的滑膜中含有功能性破骨細胞前體細胞，與穩態骨重塑中常規破骨細胞前體不同，并將其定義為AtoMs（關節炎相關的破骨細胞巨噬細胞）（圖1）。

圖1 炎性滑膜中AtoMs具有較高的破骨細胞分化潛能

2. RNA-Seq分析鑒定FoxM1是R3 ’細胞的關鍵調控因子之一

通過RNA-Seq對R1、R2 ’ 、R3’細胞進行分析表明，R3'細胞優先表達破骨細胞標記基因（Ctsk，Acp5，Mmp9，Atp6v0d2和Ppargc1b），基因集富集分析（GSEA）顯示R3’細胞中與破骨細胞分化、線粒體翻譯和氧化磷酸化相關的基因表達量增加。通過對R3’進行全局mRNA表達譜分析發現FoxM1是R3’細胞的關鍵調控因子，并通過體內、體外實驗驗證FoxM1的缺失會顯著抑制破骨細胞生成并減輕關節處的骨侵蝕（圖2）。

圖2 RNA-Seq鑒定FoxM1是R3 ’細胞的關鍵調控因子之一

3. BD Rhapsody?單細胞靶向測序鑒定出有破骨細胞表型的新細胞亞群

研究人員從CIA小鼠滑膜中分離出8682個R3細胞，使用BD Rhapsody?單細胞多組學平臺，定制BD小鼠免疫應答panel（包括Acp5、Ctsk、Atp6v0d2、Foxm1、Itgb3、Nfatc1在內的404個關聯基因）進行單細胞靶向測序（Targeted single-cell RNA-Seq）。成功構建文庫后，在Illumina HiSeq 3000平臺進行測序，分析特異性表達鑒定新型細胞亞群[i1] P1表現出破骨細胞表型。如圖3所示，相比較其他簇優先表達趨化因子受體和炎性細胞因子，P1細胞群體優先表達包括Foxm1在內的破骨細胞相關基因。

圖3 CIA小鼠滑膜R3細胞的單細胞靶向測序分析

4. 類風濕性關節炎患者的滑膜中得到較高形成破骨細胞潛能的細胞類群

最后，使用CX3CR1和HLA-DR等破骨細胞標志基因來鑒定人類類風濕性關節炎患者的血液、滑液和滑膜組織中具有高破骨細胞潛力的細胞亞群。圖4所示，從滑膜組織樣本中得到CX3CR1 ⁺ HLA-DR^hiCD11c ⁺ CD86 ⁺細胞群體（對應小鼠AtoMs）具有很高的破骨細胞形成和Foxm1表達的潛力。FoxM1抑制劑thiostrepton抑制了人類破骨細胞形成，從而揭示了類風濕關節炎治療的潛在靶標。

圖4 類風濕性關節炎患者滑膜中CX3CR1+HLA-DRhiCD11c+CD86+細胞具有較高的形成破骨細胞潛能

原文鏈接；https://doi.org/10.1038/s41590-019-0526-7