上一期小編推出烈冰生物關(guān)鍵技術(shù)——冷凍切片制備之后，很多老師都表示很感興趣，銷售部同事訂單直線增加。小編整理售前答疑的過程中，發(fā)現(xiàn)有老師們對(duì)樣本準(zhǔn)備階段有很多疑問。那么，本期小編就來詳細(xì)介紹一下空間轉(zhuǎn)錄組（Spatial Transcriptome）樣本制備過程的具體問題，提供詳細(xì)的樣本準(zhǔn)備指南，助力每一份珍貴的樣本都能順利進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)。

烈冰可接受樣本類別：凍存組織，OCT包埋組織。如果樣本充足，最好準(zhǔn)備2份及以上，一份用于RNA質(zhì)控和后續(xù)的正式切片實(shí)驗(yàn)；一份留作備用；如果組織樣本珍貴稀缺，可以酌情減少樣本數(shù)量。

我們請(qǐng)到了烈冰實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)大神Dr.Han親自上手，針對(duì)小鼠的不同組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不斷對(duì)樣本制備操作步驟進(jìn)行優(yōu)化， 為老師們實(shí)際操作排雷填坑。

• 空間轉(zhuǎn)錄組visium捕獲芯片的限制（6.5mmX6.5mm），選擇樣本前，應(yīng)先確認(rèn)好最佳取材位置以及合理組織大小，保證visium芯片的有效利用率。

• 新鮮組織樣本取下后迅速用預(yù)冷的PBS溶液或者生理鹽水沖洗組織表面殘留，然后用干凈的吸水紙吸干液體。（此步驟一定要吸干水分，如有液體殘留，OCT包埋后，組織表面形成冰晶，影響切片效果）

• 整個(gè)樣本處理過程需要保持低溫環(huán)境（干冰/液氮）

• 先將裝異戊烷的容器放置液氮中預(yù)冷15分鐘,同時(shí)將所有過程中的采集器具進(jìn)行預(yù)冷。

• 用預(yù)冷的樣本匙將新鮮組織浸沒在異戊烷中.速凍1min或直至組織完全冷凍。

• 采用異戊烷而不是液氮的原因是液氮的沸點(diǎn)低，組織直接放入液氮后會(huì)沸騰，在組織周圍產(chǎn)生氣穴，導(dǎo)致組織降溫過程中不同區(qū)域降溫不同，改變組織內(nèi)部形態(tài)甚至碎裂，影響組織形態(tài)。因此該步驟一定要用異戊烷進(jìn)行凍存，如果沒有異戊烷，可以跳過該步驟，直接將新鮮組織進(jìn)行OCT包埋后速凍。

• 將OCT放在冰上進(jìn)行預(yù)冷，包埋模具做好標(biāo)記，以確認(rèn)組織方向；

• 在包埋模具中加入一層OCT包埋劑，然后用預(yù)冷的鑷子迅速將組織放入；

• 用OCT覆蓋組織，使之完全包埋住。確認(rèn)組織周圍沒有氣泡；立即將其放在干冰上，直至OCT完全凍結(jié)。該步驟要保證最終組織周圍無氣泡產(chǎn)生，氣泡的產(chǎn)生會(huì)在OCT冷卻后在組織周圍形成空洞，影響切片效果。

質(zhì)控I：RIN值檢測(cè)，RIN值>7進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，保證組織的RNA完整。

• 如果送樣充足，可以針對(duì)組織塊進(jìn)行RNA抽提檢驗(yàn)；

• 如果樣本珍貴，也可以在正式冷凍切片前切取一定量的切片進(jìn)行RNA抽提檢測(cè)。

• 為了最大程度減少樣本的損失，并保證實(shí)驗(yàn)的有效性，烈冰實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)針對(duì)小鼠不同組織，根據(jù)組織大小、切片厚度，對(duì)20張切片的RNA總量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)正式實(shí)驗(yàn)中質(zhì)控所需的切片數(shù)量起到參考作用，避免造成浪費(fèi)。

質(zhì)控II：HE染色成像，保證冷凍切片的空間結(jié)構(gòu)的完整性。前期樣本準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)操作失誤會(huì)嚴(yán)重影響冷凍切片的空間組織形態(tài)。

• 新鮮組織樣本如果表面液體沒有吸干，直接進(jìn)行凍存切片會(huì)在組織周圍產(chǎn)生冰晶，增加組織脆性，不易切片成功，或者HE染色成像后出現(xiàn)條狀裂紋。

• OCT包埋如果不注意處理氣泡，切片時(shí)會(huì)出現(xiàn)空洞現(xiàn)象，造成切片不連續(xù)，影響切片質(zhì)量。

• 冷凍切片時(shí)必須保證切片無褶皺、光滑平整，組織無折疊、卷曲。

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